Metode za pronalaženje molekularne težine proteina su hemijske, fizičko-hemijske i fizičke. Najčešće fizičko-hemijske metode su gel hromatografija (i kolona i tankoslojni) i elektroforeza u poliakrilamidnom gel mediju u prisustvu natrijum dodecil sulfata. Ne zahtijevaju složenu opremu i velike količine ispitnog materijala.
Karakterizacija proteina
Proteini su polimeri visoke molekularne težine biološkog porijekla. Sastoje se od aminokiselina povezanih u nizu peptidnim vezama. Veličina proteina ovisi o broju tih istih aminokiselina. Prosječne vrijednosti elementarnog sastava proteina u %:
- karbon - u rasponu od 50, 6-54, 5;
- kiseonik – unutar 21,5-23,5;
- dušik - oko 15,0-17,6;
- vodonik - u rasponu od 6, 5-7, 3;
- sumpor – unutar 0, 3-2, 5;
- mineralne supstance - ne više od 0,5.
Proteini se dijele na jednostavne, koje se sastoje samo od aminokiselinskih ostataka, i složene, uključujući prostetske grupe. Neproteinske komponente mogu biti ugljikohidrati, lipidi, nukleinske kiseline, derivati vitamina, joni metala, hem, itd. Postoje četiri strukture proteina.
Sastav aminokiselina proteina se pronalazi kiselinskom hidrolizom, u kombinaciji sa naknadnim odvajanjem oslobođenih aminokiselina pomoću hromatografije sa izmenom jona.
Kvantitativni pokazatelji svake od aminokiselina određuju se ninhidrinskom metodom. Otkrivanje lokacije aminokiselina u proteinskoj molekuli vrši se uzastopnim cijepanjem terminalnih aminokiselina uz pomoć enzima i njihovom identifikacijom, što omogućava određivanje strukture proteinske molekule. Identifikacija se zasniva na njihovim različitim fizičko-hemijskim svojstvima. Često se za to koriste reakcije u boji za određene aminokiseline i hromatografija.
Kolonska gel hromatografija
Ova metoda se zasniva na linearnoj zavisnosti logaritma molekularne težine mnogih globularnih proteina i zapremine eluiranja sa napunjenim gelom (određene veličine pora). Dakle, da bi se odredila molekularna težina proteina, treba samo pronaći volumen njegovog eluiranja iz prethodno kalibrirane kolone. Kalibracija se izvodi propuštanjem proteina sa unaprijed određenim masama molekula kroz kolonu i mjerenjem zapremine eluiranja svakog od njih. Ako se Sephadex G-75 koristi kao punilo, tada se izračunavanje molekulske težine vrši prema jednadžbi koja je eksperimentalno pronađena:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), gde je M željeni molekultežina; Ve – zapremina rastvora sa ispitivanom supstancom koja izlazi iz kolone; Vo – slobodan volumen kolone.
Za analizu će vam trebati rastvor plavog dekstrana (1%), rastvor NaCl (0,1 mol/l), Sephadex G-75 (4 g), rastvor hemoglobina (1%).
Izvršite analizu
Pripremljena kolona je napunjena Sephadex G-75 gelom i isprana rastvorom NaCl. Nakon što se otopina NaCl koja se diže iznad nivoa gela iscijedi, na njegovu površinu pažljivo se stavi 0,5 ml otopine plavog dekstrana. Zatim se tečnosti koje izlaze iz kolone sakupljaju u graduisani cilindar, gde se čuvaju do kraja eksperimenta. U unaprijed pripremljene epruvete skuplja se otopina plave boje koja počinje da teče u 20 kapi. Eluat iz njih, od prve do najintenzivnije obojene, ulijeva se u isti gradirani cilindar, u kojem su već sakupljene neobojene frakcije. Zapremina epruveta blede boje rastvora se ne uzima u obzir.
Zapremina tečnosti prikupljene u graduiranom cilindru je slobodna zapremina kolone (Vo). Zatim se ponavlja punjenje kolone, ali umjesto plavog dekstrina koristi se otopina hemoglobina. Zapremina eluata u mjernom cilindru dok se otopina sa maksimalno ružičastom bojom ne oslobodi je vrijednost Ve. Pronađene vrijednosti Vo i Ve se zamjenjuju u odgovarajuću jednačinu i izračunava se masa proteina. Sastav aminokiselina proteina je pronađen sličnim metodama.
Toslojni gel-hromatografija
Princip ove metode leži u činjenici da se tokom napredovanja rastvora proteina po ploči sa najtanjim slojem sephadexa njihova mešavina neravnomerno raspoređuje. Iz udaljenosti koju je svaki od proteina prešao od prvobitne početne linije, pronađite logaritme njihove molekularne težine. Da bi se odredila molekularna težina proteina tankoslojnom gel hromatografijom, konstruiše se kalibracioni grafikon koji odražava zavisnost pređenih udaljenosti od strane proteina markera o logaritmima njihove molekularne težine. Već koristeći ga, pronađena je dužina puta proteina koji se proučava i masa njegovog molekula.
Za izvođenje eksperimenta trebat će vam pozornica s promjenjivim uglom nagiba, kao i hromatografska komora. Od reagensa će vam trebati Sephadex G-200 ili G-150, natrijum fosfatni pufer, pH 7,4 (0,1 mol/l), rastvor bromofenol plavog (0,1%), CH 3rastvorCOOH (5%), CH3COONa rastvor (2%), komplet proteinskih markera, hromatografski papir.
Izvođenje eksperimenta
Prvo je potrebno pripremiti Sephadex gel za koji se njegova suha masa od 4 g suspendira u višku količine natrijum fosfatnog pufera, a zatim ostavi da bubri 3 dana na n.o. Staklena ploča sa stranicama 20x40 cm se dobro opere. Prije nanošenja Sephadexa na njega, pufer iznad njega se dekantira, a zatim se gel dobro promiješa. Nanosi se porculanskom kašikom na horizontalno postavljen tanjir, a zatim raspoređuje valjanjem staklenog štapića veličine 1x22 cm. Razmatranje se ponavlja dok se ravnomerno ne rasporedi sloj gela bez grudvica i mehurića debljine 1mm. Pripremljena ploča se suši na vazduhu 15 minuta, a zatim stavlja u hromatografsku komoru.
Fosfatni pufer se sipa u spoljne posude, gel se kombinuje sa puferom sa hromatografskim papirom. Zatim se komora zatvara i postavlja na posebno postolje. Ugao njegovog nagiba je postavljen na 7-10°. Ostavite komoru preko noći da se zasiti.
Otvori proteina čija je molekulska težina poznata, kao i uzorci koji se proučavaju, nanose se mikropipetom, zapremina svake porcije treba da bude 0,02 ml. Ploča se vraća u horizontalni položaj i dijelovi proteina se nanose na određene točke. Udaljenost između njih i od gornje ivice treba biti 3 cm. Zatim se komora zatvori i postavi pod uglom od 7-10°. Gel hromatografska analiza se vrši 4 sata.
Nakon predviđenog vremena, kamera se postavlja horizontalno, hromatografski papir se uklanja. Staklena ploča se postavlja na postolje u horizontalnom položaju i pravi se “replika” na hromatografskom papiru. Da biste to učinili, smota se u cijev i nanese na tanak sloj gela, postepeno se razvija. U tom slučaju, papir bi se trebao zalijepiti za njega, ali to morate učiniti pažljivo kako biste ostali netaknuti. Papir se ostavi na površini ploče 1 minut, nakon čega se suši na temperaturi od 90 °C 20 minuta. i stavljen u posebnu posudu za bojenje.
Transkript rezultata
Da bi se identifikovale proteinske zone, "replika" se stavlja u rastvor bromofenol plavog na 3 minuta. Daljeboja se mora dva puta isprati rastvorom sirćetne kiseline i fiksirati natrijum acetatom. Nakon toga, hromatografski papir se temeljito ispere u hladnoj tekućoj vodi i osuši. Zatim počinju da mjere udaljenost koju svaki protein pređe od početne tačke do centra tačke.
Prema dobijenim podacima, kalibracioni grafikon se gradi iscrtavanjem duž apscisne ose la/lst (gde je indeks a se odnosi na analizirani, a st - na standardni protein), duž y-ose - lgM. Mjerenjem udaljenosti proteinske regije testnog uzorka od početka, molekularna težina i predložena struktura proteinskog molekula se određuju korištenjem nacrtanog grafikona.
