Boja po Gramu se široko koristi u mikrobiologiji jer je to jedan od najlakših načina za razlikovanje bakterija na osnovu sastava njihovog ćelijskog zida. Prema Gramu, sve bakterije se mogu podijeliti na gram-pozitivne (Gram (+)) i gram-negativne (Gram (-)). Metoda bojenja po Gramu razvijena je 1884. godine i od tada nije izgubila popularnost, iako je modificirana nekoliko puta.
Struktura ćelijskog zida
Bojenje po Gramu otkriva da li je bakterija Gram-pozitivna ili Gram-negativna. Podjela bakterija na Gram (+) i Gram (-) vrši se u skladu sa strukturom njihovog ćelijskog zida.
Ćelijski zid sadrži najveću količinu peptidoglikana (mureina) - kompleksne supstance, koja uključuje peptapeptid i glikan. Glikan se sastoji od naizmjeničnih ostataka N-acetilglukozamina i N-acetilmuramske kiseline međusobno povezanih pomoću β-1,4-glikozidne veze. Peptidoglikan pruža održavanje oblika ćelije, osmotsku zaštitu i antigenske funkcije.
Glavne razlike između Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija
Različite bakterije imaju različite debljine sloja peptidoglikana. Kod bakterija koje su klasifikovane kao gram-pozitivne, on se kreće od 15 do 80 nm, dok je kod gram negativnih od 2 do 8 nm. Istovremeno, Gram-negativne bakterije imaju posebnu strukturu ispod peptidoglikanskog sloja, koju Gram-pozitivne bakterije nemaju - periplazmatski prostor. Ovaj prostor je ispunjen hidrolitičkim enzimima - β-laktamaza, ribonukleaza 1, fosfataza. Upravo su ovi enzimi odgovorni za rezistenciju gram-negativnih bakterija na mnoge antibiotike.
Gram(-) peptidoglikanski sloj bakterije je vezan za lipopolisaharid, antigensku strukturu koja sadrži endotoksin. U Gram(+) bakterijama, teihoične kiseline obavljaju slične funkcije.
Gram-negativne bakterije imaju dodatnu strukturu - vanjsku membranu.
Suština metode bojenja
Pre nego što počnete sa bojenjem, pripremaju se razmazi proučavanih bakterija. Da biste to učinili, voda se kapa na staklenu pločicu i tamo se dodaje kultura mikroorganizama pomoću bakterijske petlje. Zatim, nakon što se voda potpuno osuši, mrlja se fiksira - staklo se više puta prenese preko plamena plamenika. Bojenje po Gramu je efikasnije od bojenja živih bakterija - molekuli boje se bolje vežu za mrtve ćelije.
Bojenje se vrši u nekoliko faza:
- Mali komadi filter papira se stavljaju na fiksni razmaz i sipa se glavna boja - gentian violet ili metilen plavo.
- Nakon 3-5 minuta, uklonite filter papir u boji i punite razmaz Lugolovom otopinom 1 minut. U ovom slučaju preparat potamni.
- Lugol rastvor se ocijedi i bris se tretira čistim etil alkoholom: nekoliko kapi se nakapa na preparat, ocedi nakon 20 sekundi. Postupak se ponavlja 2-3 puta.
- Isperite stakalce za testiranje destilovanom vodom.
- Proizvesti dodatno bojenje - završiti pripremu sa fuksinom. Nakon 1-2 minute, boja se ispere.
- Nakon što se voda osuši, pregledajte razmaz pod mikroskopom. Gram-pozitivne bakterije će biti plavo-ljubičaste, Gram-negativne bakterije će biti ružičaste ili crvene.
Uzroci različitih uzoraka bojenja
Kao što je gore opisano, bojenje bakterija po Gramu boji Gram-pozitivne bakterije u plavo-ljubičasto, dok Gram-negativne bakterije boje crveno ili ružičasto. Razlog za diferencijalno bojenje bakterija ovom metodom je taj što nakon što rastvorljivi oblik gentian violet-a uđe u ćeliju, boja prelazi u netopivi oblik joda. Tokom tretmana bakterija etil alkoholom, lipidi se ekstrahuju iz membrane pod dejstvom ovog nepolarnog rastvarača. Membrana tada postaje porozna i više nije značajna prepreka za ispiranje boje. kako godpeptidoglikan je otporniji na nepolarne rastvarače, uključujući alkohol. On je taj koji sprečava ispiranje boje, pa bakterije sa debelim slojem mureina postaju plavoljubičaste (gram-pozitivne), a nakon tretmana alkoholom ne menjaju boju.
Tanki mureinski sloj gram-negativnih bakterija ne može zadržati molekule boje u ćeliji, pa nakon djelovanja alkohola one postaju bezbojne - mrlje gram-negativne.
Nakon izlaganja razmaza fuksinu, bakterije obojene po Gramu ostaju plavoljubičaste, dok gram-negativne bakterije postaju ružičasto-crvene.
Primjeri Gram(+) i Gram(-) bakterija
Gram-negativne bakterije uključuju cijanobakterije, bakterije sumpora, bakterije gvožđa, klamidiju, rikecije, sirćetne bakterije, mnoge metilobakterije, tionske bakterije, arsenitobakterije, karboksibakterije.
Bifidobakterije, mnoge vodene bakterije, streptokoke i stafilokoke su Gram-pozitivne.
