Šta leži u osnovi DNK hibridizacije? Iako je dvolančana DNK sekvenca općenito stabilna u fiziološkim uvjetima, promjena ovih uvjeta u laboratoriji (obično povećanjem temperature okoline) dovešće do razdvajanja molekula u pojedinačne niti. Potonji su komplementarni jedni drugima, ali mogu nadopunjavati i druge sekvence prisutne u njihovom okruženju. Smanjenje temperature okoline omogućava jednolančanim molekulima da se žare ili "hibridiziraju" jedni s drugima. Ovo je metoda hibridizacije DNK.
Koncept sa stanovišta molekularne biologije
Naučnici uključeni u replikaciju DNK i transkripciju DNK u RNK oslanjaju se na ukrštanje nukleotida i tehnike molekularne biologije. Ovo uključuje Southern i Northern blot, lančanu reakciju polimeraze (PCR) i većinu DNK-RNA hibridizacije i pristupa sekvenciranju.
Prijava
Hibridizacija je glavno svojstvo nukleotidasekvence i koristi se u brojnim metodama molekularne biologije. Ukupni genetski odnos dvije vrste može se odrediti hibridizacijom segmenata njihove DNK (DNK-DNK hibridizacija). Zbog sličnosti sekvenci između blisko povezanih organizama, potrebna je viša temperatura da bi se takvi DNK hibridi rastopili u poređenju sa udaljenijim organizmima. Različite metode koriste hibridizaciju za određivanje porijekla uzorka DNK, uključujući lančanu reakciju polimeraze (PCR). U drugoj metodi, kratke sekvence DNK se hibridiziraju sa ćelijskom mRNA da bi se identificirali eksprimirani geni. Farmaceutske kompanije istražuju upotrebu antisens RNK da se vežu na neželjenu mRNA, sprečavajući ribozom da prevede mRNA u protein.
DNA-DNK hibridizacija općenito se odnosi na tehniku molekularne biologije koja mjeri stepen genetske sličnosti između skupova DNK sekvenci. Obično se koristi za određivanje genetske udaljenosti između dva organizma. Široko se koristio u filogeniji i taksonomiji.
Metodologija
DNK iz jednog organizma je označena, a zatim pomešana sa neobilježenom DNK koja se mogla uporediti s njim. Smjesa se inkubira kako bi se omogućilo da se DNK lanci disociraju, a zatim ohladi da se formira regenerirana hibridna dvolančana DNK. Hibridizovane sekvence sa visokim stepenom sličnosti će se čvršće vezati i zahtevaće više energije da ih razdvoje: tj. odvajaju se kada se zagreju na višojtemperatura od različitih sekvenci, proces poznat kao "topljenje DNK".
topljenje DNK
Procjenjujući profil topljenja hibridizirane DNK, dvolančana DNK se vezuje za takozvani "stupac" i rezultirajuća smjesa se zagrijava. U svakom koraku, kolona se ispere i DNK sekvence koje se tope postaju jednolančane i ispiru se sa kolone. Temperature na kojima označena DNK izlazi iz kolone odražava količinu sličnosti između sekvenci (a uzorak samosavijanja služi kao kontrola). Ovi rezultati su kombinovani kako bi se odredio stepen genetske sličnosti između organizama. Prema modernoj mikrobiologiji, hibridizacija DNK je nemoguća bez razumijevanja ovih stvari.
Kada se više vrsta ribonukleinske kiseline (ili deoksiribonukleinske) kiseline uporede na ovaj način, vrijednosti sličnosti omogućavaju da se vrsta smjesti u filogenetsko stablo. Stoga je ovo jedan od mogućih pristupa za provođenje molekularne sistematike. Charles Sibley i John Ahlquist, pioniri ove tehnike, koristili su DNK-DNK hibridizaciju da proučavaju filogenetske odnose ptica (taksonomija Sibley-Ahlquist) i primata.
Važnost za biologiju
DNK-DNK hibridizacija je zlatni standard za razlikovanje bakterijskih vrsta, sa vrijednošću sličnosti većom od 70%, što ukazuje da upoređeni sojevi pripadaju različitim vrstama. Godine 2014. predložen je prag od 79% sličnosti za odvajanje bakterijske podvrste.
Kritičari tvrde da je tehnika netačna za poređenje blisko srodnih vrsta, jer je svaki pokušaj mjerenja razlika između ortolognih sekvenci između organizama preopterećen hibridizacijom paralognih parnjaka u genomu organizma. Sekvenciranje DNK i kompjutorska poređenja sekvenci trenutno su najčešće korištena metoda za određivanje genetske udaljenosti, iako se ovaj pristup još uvijek koristi u mikrobiologiji kako bi pomogao u identifikaciji bakterija.
Trenutni način je izvođenje DNK-DNK hibridizacije u silikonu koristeći potpuno ili djelomično sekvencionirane genome. GGDC koji je razvio DSMZ je najprecizniji poznati alat za izračunavanje vrijednosti sličnih DDH. Između ostalih algoritamskih poboljšanja, rješava problem s paralognim sekvencama tako što ih pažljivo filtrira iz podudarnosti između dvije sekvence genoma.
FISH metoda
Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) je laboratorijska tehnika koja se koristi za otkrivanje i sekvenciranje DNK, često na određenom hromozomu.
Godine 1969., Joseph Gall i Mary Lou Pardu objavili su rad koji demonstrira da se radioaktivne kopije ribosomske sekvence DNK mogu koristiti za otkrivanje komplementarnih sekvenci DNK u jezgru žabljeg jajeta. Od ovih originalnih zapažanja, mnoga poboljšanja povećala su svestranost iosjetljivost postupka do te mjere da se in situ hibridizacija ("na mjestu", latinski) sada smatra važnim alatom u citogenetici. (Izraz in situ se sada koristi i za početnu fazu rasta karcinoma, kada je samo epitelno tkivo uključeno u patološki proces.)
Fluorescentna hibridizacija sekvence
RNA sonde mogu biti dizajnirane za bilo koji gen ili bilo koju sekvencu unutar gena za vizualizaciju lncRNA i miRNA mRNA u tkivima i ćelijama. FISH se koristi proučavanjem ciklusa reprodukcije ćelija, posebno nuklearne interfaze za bilo kakve hromozomske abnormalnosti. FISH vam omogućava da analizirate veliku seriju arhivskih slučajeva, mnogo je lakše identificirati identificirani hromozom kreiranjem sonde sa vještačkom bazom hromozoma koja će privući slične hromozome.
Hibridizacijski signali za svaku sondu kada se otkrije nuklearna abnormalnost: svaka mRNA i lncRNA detekciona sonda se sastoji od 20 parova oligonukleotida, svaki par pokriva prostor od 40-50 bp. p. Sonde koriste zaštićenu hemiju za otkrivanje mRNA.
Hibridizacija sa DNK sondama
Probe se često prave od fragmenata DNK koji su izolovani, pročišćeni i pojačani za upotrebu u dizajnu ljudskog genoma. Veličina ljudskog genoma je toliko velika u odnosu na dužinu koja se može direktno sekvencirati da ga je potrebno podijeliti nafragmenti. Konačno, ovi fragmenti su poređani tako što su kopiju svakog fragmenta razgradili u još manje jedinice koristeći endonukleaze specifične za sekvencu kako bi se izmjerila veličina svakog malog fragmenta korištenjem hromatografije isključivanja veličine koristeći ove informacije kako bi se utvrdilo gdje se veliki fragmenti preklapaju jedan s drugim.
Da bi se sačuvali elementi sa njihovim pojedinačnim sekvencama DNK, fragmenti su dodati sistemu bakterijskih populacija koje se stalno ponavljaju. Klonske populacije bakterija, od kojih svaka populacija održava jedan umjetni kromosom, pohranjene su u različitim laboratorijama širom svijeta. Umjetni hromozomi (BAC) mogu se uzgajati, ekstrahirati i obilježavati u bilo kojoj laboratoriji koja sadrži biblioteku. Genomske biblioteke često se nazivaju po institucijama u kojima su razvijene. Primjer je biblioteka RPCI-11, nazvana po Roswell institutu za rak u Buffalu (Njujork, SAD). Ovi fragmenti čine oko 100 hiljada parova baza i osnova su većine FISH sondi.
