Postoji mnogo različitih metoda za analizu sastava i proučavanje svojstava različitih spojeva i mješavina supstanci. Jedna takva metoda je hromatografija. Autorstvo u pronalasku i primeni metode pripada ruskom botaničaru M. S. Cvetu, koji je početkom 20. veka izvršio odvajanje biljnih pigmenata.
Definicija i osnove metode
Hromatografija je fizičko-hemijska metoda za odvajanje smjesa i određivanje njihovih komponenti, zasnovana na raspodjeli između pokretne i stacionarne faze supstanci koje čine smjesu (uzorak). Stacionarna faza je porozna čvrsta tvar - sorbent. To također može biti tekući film nanijet na čvrstu površinu. Mobilna faza - eluent - mora se kretati duž stacionarne faze ili teći kroz nju, filtrirajući je sorbentom.
Suština hromatografije je da različite komponente smeše nužno karakterišu različita svojstva, kao što su molekulska težina, rastvorljivost, sposobnost adsorpcije, itd. Dakle, brzina interakcije komponenti mobilne faze - sorbata - sa stacionarnomnije isto. To dovodi do razlike u brzinama molekula smjese u odnosu na stacionarnu fazu, zbog čega se komponente razdvajaju i koncentrišu u različitim zonama sorbenta. Neki od njih napuštaju sorbent zajedno sa mobilnom fazom - to su takozvane nezadržane komponente.
Posebna prednost hromatografije je ta što vam omogućava da brzo odvojite složene mešavine supstanci, uključujući i one sa sličnim svojstvima.
Metode za klasifikaciju tipova hromatografije
Metode korištene u analizi mogu se klasificirati prema različitim kriterijima. Glavni skup takvih kriterija je sljedeći:
- agregatno stanje stacionarne i mobilne faze;
- fizička i hemijska priroda interakcije sorbenta i sorbata;
- kako uvesti eluent i premjestiti ga;
- metoda postavljanja stacionarne faze, odnosno tehnika hromatografije;
- kromatografske mete.
Osim toga, metode se mogu zasnivati na različitoj prirodi procesa sorpcije, na tehničkim uslovima hromatografskog odvajanja (na primjer, niski ili visoki tlak).
Hajde da pobliže pogledamo gore navedene glavne kriterije i najčešće korištene vrste hromatografije povezane s njima.
Eluent i sorbent stanje agregacije
Po ovom osnovu, hromatografija se deli na tečnu i gasnu. Nazivi metoda odražavaju stanje mobilne faze.
Tečna hromatografija je tehnika koja se koristiu procesima odvajanja mješavina makromolekularnih spojeva, uključujući i one biološki važne. U zavisnosti od stanja agregacije sorbenta, deli se na tečno-tekuću i tečno-čvrstu fazu.
Plinska hromatografija je sljedećih tipova:
- Adsorpcija gasa (gas-čvrsta faza), koja koristi čvrsti sorbent, kao što je ugalj, silika gel, zeoliti ili porozni polimeri. Inertni gas (argon, helijum), dušik, ugljični dioksid djeluje kao eluent - nosač smjese koja se odvaja. Odvajanje isparljivih komponenti smjese vrši se zbog različitog stepena njihove adsorpcije.
- Gas-tečnost. Stacionarna faza se u ovom slučaju sastoji od tečnog filma nanesenog na čvrstu inertnu podlogu. Komponente uzorka su odvojene prema njihovoj adsorpciji ili rastvorljivosti.
Plinska kromatografija se široko koristi za analizu mješavina organskih jedinjenja (koristeći njihove produkte raspadanja ili derivate u plinovitom obliku).
Interakcija između sorbenta i sorbata
Prema ovom kriterijumu razlikuju se tipovi kao:
- Adsorpciona hromatografija, putem koje se mešavine razdvajaju zbog razlike u stepenu adsorpcije supstanci nepokretnim sorbentom.
- Distribucija. Uz njegovu pomoć, razdvajanje se vrši na osnovu različite rastvorljivosti komponenti smjese. Otapanje se dešava ili u mobilnoj i stacionarnoj fazi (u tečnoj hromatografiji), ili samo u stacionarnoj fazi (u gasno-tečnojhromatografija).
- Sedimentni. Ova metoda hromatografije zasniva se na različitoj rastvorljivosti formiranih precipitata supstanci koje se odvajaju.
- Izuzimanje ili gel hromatografija. Zasnovan je na razlici u veličini molekula, zbog čega varira njihova sposobnost prodiranja u pore sorbenta, tzv. gel matrice.
- Afino. Ova specifična metoda, koja se zasniva na posebnom tipu biohemijske interakcije odvojenih nečistoća sa ligandom koji formira kompleksno jedinjenje sa inertnim nosačem u stacionarnoj fazi. Ova metoda je efikasna u odvajanju mješavine proteina-enzima i uobičajena je u biohemiji.
- Jonska izmjena. Kao faktor razdvajanja uzoraka, ova metoda koristi razliku u sposobnosti komponenti smjese da razmjenjuju jone sa stacionarnom fazom (jonski izmjenjivač). U toku procesa se joni stacionarne faze zamenjuju ionima supstanci u sastavu eluenta, dok zbog različitog afiniteta potonjeg prema jonskom izmenjivaču nastaje razlika u brzini njihovog kretanja, a samim tim i smjesa se odvaja. Za stacionarnu fazu najčešće se koriste jonoizmenjivačke smole - specijalni sintetički polimeri.
Iono-izmjenjivačka hromatografija ima dvije opcije - anionsku (zadržava negativne ione) i kationsku (zadržava pozitivne ione, respektivno). Ova metoda se koristi izuzetno široko: u separaciji elektrolita, rijetkih zemnih i transuranskih elemenata, u prečišćavanju vode, u analizi lijekova.
Razlika u metodama tehnike
Postoje dva glavna načina na koje se uzorak kreće u odnosu na stacionarnu fazu:
- Kolonska hromatografija vrši proces separacije u posebnom uređaju - hromatografskoj koloni - cevi, u čiju unutrašnju šupljinu je smešten nepomični sorbent. Prema načinu punjenja, kolone se dijele na dvije vrste: nabijene (tzv. "pakirane") i kapilarne, u kojima se na površinu nanosi sloj čvrstog sorbenta ili tečnog filma stacionarne faze. unutrašnjeg zida. Pakovani stubovi mogu imati različite oblike: ravni, u obliku slova U, spiralni. Kapilarni stubovi su spiralni.
- Planarna (planarna) hromatografija. U tom slučaju se kao nosač za stacionarnu fazu može koristiti poseban papir ili ploča (metalna, staklena ili plastična), na koju se nanosi tanak sloj sorbenta. U ovom slučaju, metoda hromatografije se naziva papirna ili tankoslojna hromatografija, respektivno.
Za razliku od kolonske metode, gdje se hromatografske kolone koriste više puta, u planarnoj hromatografiji, bilo koji nosač sa slojem sorbenta može se koristiti samo jednom. Proces odvajanja se dešava kada se ploča ili list papira urone u posudu sa eluentom.
Uvod i prijenos eluenta
Ovaj faktor određuje prirodu kretanja hromatografskih zona duž sloja sorbenta, koje nastaju tokom odvajanja smeše. Postoje sljedeće metode isporuke eluenta:
- Prednji. Ova metoda je najjednostavnijatehnika izvođenja. Mobilna faza je direktno sam uzorak, koji se kontinuirano dovodi u kolonu ispunjenu sorbentom. U ovom slučaju, najmanje zadržana komponenta, adsorbirana lošije od ostalih, kreće se duž sorbenta brže od ostalih. Kao rezultat, samo ova prva komponenta se može izolovati u čistom obliku, praćena zonama koje sadrže mješavine komponenti. Distribucija uzorka izgleda ovako: A; A+B; A+B+C i tako dalje. Frontalna hromatografija stoga nije korisna za odvajanje smeša, ali je efikasna u različitim procesima prečišćavanja, pod uslovom da supstanca koja se izoluje ima nisku retenciju.
- Metoda istiskivanja se razlikuje po tome što se nakon ulaska u smešu koja se odvaja, u kolonu se ubacuje eluent sa posebnim displazerom - supstanca koju karakteriše veća sposobnost sorbovanja od bilo koje komponente smeše. On pomiče najzadržaniju komponentu, koja pomiče sljedeću i tako dalje. Uzorak se kreće duž kolone brzinom istiskivača i formira susjedne zone koncentracije. Sa ovom vrstom hromatografije, svaka komponenta se može dobiti pojedinačno u tečnom obliku na izlazu iz kolone.
- Metoda eluenta (razvijanja) je najčešća. Za razliku od metode istiskivanja, eluent (nosač) u ovom slučaju ima manju sposobnost sorbiranja od komponenti uzorka. Kontinuirano se prolazi kroz sloj sorbenta, ispirajući ga. Povremeno, u porcijama (impulsima), smjesa koja se odvaja se uvodi u tok eluenta, nakon čega se čisti eluent ponovo ubacuje. Prilikom ispiranja (eluiranja) komponente se odvajaju,štaviše, njihove zone koncentracije su odvojene zonama eluenta.
Eluentna hromatografija omogućava skoro potpuno odvajanje analizirane mešavine supstanci, a smesa može biti višekomponentna. Takođe, prednosti ove metode su izolacija komponenti jedna od druge i jednostavnost kvantitativne analize smjese. Nedostaci uključuju veliku potrošnju eluenta i nisku koncentraciju komponenti uzorka u njemu nakon odvajanja na izlazu iz kolone. Metoda eluenta se široko koristi u plinskoj i tečnoj hromatografiji.
Hromatografski procesi u zavisnosti od namjene
Razlika u ciljevima hromatografije omogućava razlikovanje metoda kao što su analitičke, preparativne i industrijske.
Pomoću analitičke hromatografije vrši se kvalitativna i kvantitativna analiza mješavina. Prilikom analize komponenti uzorka, pri izlasku iz kolone hromatografa, one idu do detektora - uređaja koji je osjetljiv na promjene koncentracije tvari u eluentu. Vrijeme proteklo od trenutka kada je uzorak uveden u kolonu do maksimalne vršne koncentracije tvari na detektoru naziva se vrijeme zadržavanja. Pod uslovom da su temperatura kolone i brzina eluenta konstantni, ova vrijednost je konstantna za svaku supstancu i služi kao osnova za kvalitativnu analizu smjese. Kvantitativna analiza se provodi mjerenjem površine pojedinačnih pikova u hromatogramu. Po pravilu se u analitičkoj hromatografiji koristi metoda eluenta.
Preparativna hromatografija ima za cilj da izoluje čiste supstance iz smeše. Pripremni stupovi imaju mnogo većeprečnik od analitičkog.
Industrijska hromatografija se koristi, pre svega, za dobijanje velikih količina čistih supstanci potrebnih u određenoj proizvodnji. Drugo, važan je dio savremenih sistema kontrole i regulacije tehnoloških procesa.
Industrijski hromatograf ima skalu koncentracije jedne ili druge komponente i opremljen je senzorom, kao i sistemima za kontrolu i registraciju. Uzorci se na takve hromatografe dostavljaju automatski sa određenom frekvencijom.
Multifunkcionalna hromatografska oprema
Moderni hromatografi su složeni uređaji visoke tehnologije koji se mogu koristiti u raznim oblastima iu različite svrhe. Ovi uređaji omogućavaju analizu složenih višekomponentnih mješavina. Opremljeni su širokim spektrom detektora: termičkih konduktometrijskih, optičkih, jonizacijskih, masenih spektrometrijskih i tako dalje.
Pored toga, moderna hromatografija koristi automatske sisteme kontrole za analizu i obradu hromatograma. Upravljanje se može izvršiti sa računara ili direktno sa uređaja.
Primjer takvog uređaja je multifunkcionalni plinski hromatograf "Crystal 5000". Poseduje set od četiri zamenljiva detektora, termostat na koloni, elektronske sisteme za kontrolu pritiska i protoka i kontrole gasnih ventila. Za rješavanje raznih problema uređaj imamogućnost ugradnje i pakiranih i kapilarnih kolona.
Hromatografom se upravlja pomoću potpuno opremljene tastature i kontrolnog displeja ili (u drugoj modifikaciji) sa personalnog računara. Ovaj uređaj nove generacije može se efikasno koristiti u proizvodnji iu raznim istraživačkim laboratorijama: medicinskim, forenzičkim, ekološkim.
Hromatografija visokog pritiska
Provođenje tečne kolonske hromatografije karakteriše prilično dugo trajanje procesa. Da bi se ubrzalo kretanje tečnog eluensa, koristi se dovod mobilne faze u kolonu pod pritiskom. Ova moderna i vrlo obećavajuća metoda naziva se metoda tečne hromatografije visokih performansi (HPLC).
Sistem pumpanja HPLC tečnog hromatografa isporučuje eluent konstantnom brzinom. Razvijeni ulazni pritisak može doseći 40 MPa. Kompjuterska kontrola omogućava promjenu sastava mobilne faze prema datom programu (ovaj metod elucije se naziva gradijent).
HPLC se mogu koristiti različite metode zasnovane na prirodi interakcije sorbenta i sorbata: distribucija, adsorpcija, isključenje veličine, hromatografija sa jono-izmjenjivačkom. Najčešći tip HPLC-a je metoda obrnute faze, zasnovana na hidrofobnoj interakciji polarne (vodene) mobilne faze i nepolarnog sorbenta, kao što je silika gel.
Metoda se široko koristi za odvajanje, analizu,kontrola kvaliteta neisparljivih, termički nestabilnih supstanci koje se ne mogu prevesti u gasovito stanje. To su agrohemikalije, lijekovi, komponente hrane i druge složene supstance.
Važnost studija hromatografije
Različite vrste hromatografije se široko koriste u različitim poljima:
- anorganska hemija;
- petrohemija i rudarstvo;
- biohemija;
- medicina i farmaceutski proizvodi;
- prehrambena industrija;
- ekologija;
- kriminologija.
Ova lista je nepotpuna, ali odražava pokrivenost industrija koje ne mogu bez hromatografskih metoda analize, odvajanja i prečišćavanja supstanci. U svim oblastima primene hromatografije, od naučnih laboratorija do industrijske proizvodnje, uloga ovih metoda je sve veća kako se uvode savremene tehnologije za obradu informacija, upravljanje i kontrolu složenih procesa.
