Metoda kulture tkiva jedan je od glavnih alata moderne biotehnologije, koji omogućava rješavanje praktičnih problema fiziologije, biohemije i genetike biljaka. Veštačka kultivacija materijala vrši se pod određenim uslovima: sterilizacija, kontrola temperature i izlaganje posebnom hranljivom mediju.
Essence
Metoda kulture tkiva je njihovo dugoročno čuvanje i/ili veštačka kultivacija u laboratorijskim uslovima na hranljivoj podlozi. Ova tehnologija vam omogućava da kreirate biološki model za proučavanje različitih procesa u ćelijama koje postoje izvan tela biljaka, ljudi i životinja.
Razmnožavanje kulture biljnog tkiva zasniva se na svojstvu totipotentnosti - sposobnosti ćelija da se razviju u čitav organizam. Kod životinja se to ostvaruje samo u oplođenim jajima (sa izuzetkom nekih vrsta koelenterata).
Historija razvoja
Prve pokušaje uzgoja biljnih tkiva napravili su njemački naučnici na prijelazu iz 19. u 20. vijek. Uprkos činjenici da su bile neuspešne, formulisano je nekoliko ideja, koje su kasnije potvrđene.
Godine 1922, W. Robbins i W. Kotte, nezavisno jedan od drugog, uspeli su da uzgajaju vrhove korena kukuruza i paradajza na veštačkoj hranljivoj podlozi. Detaljno proučavanje tehnika kulture ćelija i tkiva počelo je 1930-ih. 20ti vijek R. Gautre i F. White dokazali su da uz periodičnu transplantaciju kultura tkiva u svježu hranjivu podlogu, one mogu rasti neograničeno.
Do 1959. godine, 142 biljne vrste uzgajane su u laboratorijskim uslovima. U drugoj polovini XX veka. takođe je počela upotreba dispergovanih (odvojenih) ćelija.
Vrste test materijala
Postoje 2 glavne vrste kultura biljnog tkiva:
- Proizvedeno bez uništavanja i sa očuvanjem karakterističnih osobina svojstvenih živom organizmu.
- Izvučeno degradacijom (hemijskom, enzimskom ili mehaničkom) iz primarnog tkiva. Može se formirati iz jedne ili više ćelijskih kultura.
Sljedeće metode razlikuju se po načinu uzgoja:
- na "sloju za hranjenje", u kojem se supstanca koja stimulira rast tkiva luči diobom stanica iste biljne vrste;
- koristeći sestrinsko tkivo pored kultiviranih ćelija;
- upotreba hranljive podloge iz izolovane grupe ćelija koje se dele;
- rast pojedinačnih ćelija u mikrokapljici zasićene sastavom.
Kultivacija iz pojedinačnih ćelija je puna određenih poteškoća. Da bi ih vještački "natjerali" da se podijele, moraju primiti signal od susjednih, aktivno funkcionalnih ćelija.
Jedan od glavnih tipova tkiva za fiziološka istraživanja je kalus, koji nastaje pod nepovoljnim vanjskim faktorima (obično mehaničke ozljede). Imaju sposobnost da izgube specifične karakteristike svojstvene izvornom tkivu. Kao rezultat, ćelije kalusa počinju da se aktivno dijele i formiraju se dijelovi biljke.
Neophodni uslovi
Uspjeh metode kulture tkiva i ćelija ovisi o sljedećim faktorima:
- Poštivanje sterilnosti. Za transplantaciju se koriste posebne kutije s dovodom pročišćenog zraka, opremljene ultraljubičastim lampama. Alati i materijali, odjeća i ruke osoblja trebaju biti podvrgnuti aseptičnoj obradi.
- Upotreba posebno odabranih hranjivih podloga koji sadrže izvore ugljika i energije (obično saharozu i glukozu), mikro- i makronutrijente, regulatore rasta (auksini, citokinini), vitamine (tiamin, riboflavin, askorbinsku i pantotensku kiselinu i druge).
- Usklađenost sa temperaturom (18-30°C), svjetlosnim uslovima i vlažnošću (60-70%). Većina kultura tkiva kalusa uzgaja se pod ambijentalnim svjetlom jer ne sadrže hloroplaste, ali neke biljke zahtijevaju pozadinsko osvjetljenje.
Trenutno gotovakomercijalni sastavi (Murasige i Skoog, Gamborg i Eveleg, White, Kao i Mikhailyuk i drugi).
Za i protiv
Prednosti metode kulture ćelija i tkiva su:
- dobra ponovljivost dobijenih rezultata;
- regulacija međućelijskih interakcija;
- mala potrošnja reagensa;
- genetička homogenost ćelijskih linija;
- mogućnost mehanizacije procesa uzgoja;
- kontrola nad uslovima u kavezu;
- skladištenje živih kultura na niskoj temperaturi.
Nedostatak ove biotehnologije je:
- treba poštivati stroge uslove asepse;
- nestabilnost svojstava ćelija i mogućnost njihovog nepoželjnog miješanja;
- visoka cijena hemikalija;
- nepotpuna ekvivalencija kultiviranih tkiva i ćelija u živom organizmu.
Prijava
Metoda kulture tkiva korištena za istraživanje:
- procesi unutar ćelija (sinteza DNK, RNK i proteina, metabolizam i uticaj na njega uz pomoć lekova);
- međustanične reakcije (prolazak supstanci kroz ćelijske membrane, rad hormonsko-receptorskog kompleksa, sposobnost ćelija da se prianjaju jedna za drugu, formiranje histoloških struktura);
- interakcije sa okolinom (apsorpcija hranljivih materija, prenošenje infekcija, procesi nastanka i razvojatumori i drugi);
- rezultati genetskih manipulacija sa ćelijama.
Obećavajuća područja biologije i farmakologije u čijem razvoju se koristi ova tehnologija su:
- dobivanje efikasnih herbicida, regulatora rasta za agronomske usjeve, biološki aktivnih jedinjenja za upotrebu u proizvodnji lijekova (alkaloidi, steroidi i drugi);
- usmjerena mutageneza, uzgoj novih hibrida, prevazilaženje postgamne nekompatibilnosti;
- klonsko razmnožavanje, što vam omogućava da dobijete veliki broj genetski identičnih biljaka;
- uzgoj biljaka otpornih na viruse i bez virusa;
- krioprezervacija genskog fonda;
- rekonstrukcija tkiva, stvaranje izvora matičnih ćelija (tkivni inženjering).
