Apsorpcija i dalja reemisija svjetlosti od strane neorganskih i organskih medija je rezultat fosforescencije ili fluorescencije. Razlika između fenomena je dužina intervala između apsorpcije svjetlosti i emisije struje. Kod fluorescencije se ovi procesi odvijaju gotovo istovremeno, a kod fosforescencije sa određenim zakašnjenjem.
Historijska pozadina
Godine 1852, britanski naučnik Stokes je prvi opisao fluorescenciju. On je skovao novi termin kao rezultat svojih eksperimenata s fluorom, koji je emitirao crvenu svjetlost kada je bio izložen ultraljubičastom svjetlu. Stokes je primijetio zanimljiv fenomen. Otkrio je da je talasna dužina fluorescentne svetlosti uvek duža od talasne dužine ekscitacione svetlosti.
Mnogi eksperimenti su sprovedeni u 19. veku da bi se potvrdila hipoteza. Oni su pokazali da različiti uzorci fluoresciraju kada su izloženi ultraljubičastom svjetlu. Materijali uključuju, između ostalog, kristale, smole, minerale, hlorofil,medicinske sirovine, neorganska jedinjenja, vitamini, ulja. Direktna upotreba boja za biološku analizu počela je tek 1930.
opis fluorescentne mikroskopije
Neki od materijala korištenih u istraživanju u prvoj polovini 20. stoljeća bili su vrlo specifični. Zahvaljujući pokazateljima koji se ne mogu postići kontrastnim metodama, metoda fluorescentne mikroskopije postala je važan alat u biomedicinskim i biološkim istraživanjima. Dobijeni rezultati bili su od ne male važnosti za nauku o materijalima.
Koje su prednosti fluorescentne mikroskopije? Uz pomoć novih materijala postalo je moguće izolovati visoko specifične ćelije i submikroskopske komponente. Fluorescentni mikroskop vam omogućava da otkrijete pojedinačne molekule. Različite boje omogućuju identifikaciju nekoliko elemenata u isto vrijeme. Iako je prostorna rezolucija opreme ograničena granicom difrakcije, koja zauzvrat zavisi od specifičnih svojstava uzorka, detekcija molekula ispod ovog nivoa je takođe sasvim moguća. Različiti uzorci pokazuju autofluorescenciju nakon zračenja. Ovaj fenomen se široko koristi u petrologiji, botanici, industriji poluprovodnika.
Karakteristike
Proučavanje životinjskih tkiva ili patogenih mikroorganizama često je komplikovano ili preslabom ili vrlo jakom nespecifičnom autofluorescencijom. Međutim, vrijednost uistraživanje stječe uvođenje u materijal komponenti koje se pobuđuju na određenoj talasnoj dužini i emituju svjetlosni tok potrebnog intenziteta. Fluorohromi djeluju kao boje sposobne za samovezivanje na strukture (nevidljive ili vidljive). Istovremeno, odlikuju se visokom selektivnošću u odnosu na ciljeve i kvantni prinos.
Fluorescentna mikroskopija postala je naširoko korištena s pojavom prirodnih i sintetičkih boja. Imali su specifične profile intenziteta emisije i ekscitacije i bili su usmjereni na specifične biološke ciljeve.
Identifikacija pojedinačnih molekula
Često, pod idealnim uslovima, možete registrovati sjaj jednog elementa. Za to je, između ostalog, potrebno osigurati dovoljno nisku buku detektora i optičku pozadinu. Molekul fluoresceina može emitovati do 300.000 fotona prije uništenja zbog fotoizbjeljivanja. Sa stopom naplate od 20% i efikasnošću procesa, mogu se registrovati u iznosu od oko 60 hiljada
Fluorescentna mikroskopija, zasnovana na lavinskim fotodiodama ili umnožavanju elektrona, omogućila je istraživačima da posmatraju ponašanje pojedinačnih molekula nekoliko sekundi, au nekim slučajevima i minuta.
Poteškoće
Ključni problem je suzbijanje buke iz optičke pozadine. Zbog činjenice da mnogi materijali koji se koriste u konstrukciji filtera i sočiva ispoljavaju određenu autofluorescenciju, napori naučnika su u početnim fazama bili usmereni na izdavanjekomponente sa niskom fluorescencijom. Međutim, kasniji eksperimenti doveli su do novih zaključaka. Konkretno, utvrđeno je da fluorescentna mikroskopija zasnovana na totalnoj unutrašnjoj refleksiji postiže nisku pozadinu i visoku ekscitaciju svjetlosti.
Mehanizam
Principi fluorescentne mikroskopije zasnovane na totalnoj unutrašnjoj refleksiji su korištenje talasa koji se brzo raspada ili se ne širi. Nastaje na granici između medija s različitim indeksima prelamanja. U ovom slučaju, svjetlosni snop prolazi kroz prizmu. Ima visok indeks prelamanja.
Prizma je u blizini vodenog rastvora ili stakla niskog parametra. Ako se snop svjetlosti usmjeri na njega pod uglom većim od kritičnog, snop se u potpunosti odbija od sučelja. Ovaj fenomen, zauzvrat, dovodi do talasa koji se ne širi. Drugim riječima, generira se elektromagnetno polje koje prodire u medij sa nižim indeksom prelamanja na udaljenosti manjoj od 200 nanometara.
U talasu koji se ne širi, intenzitet svetlosti će biti sasvim dovoljan da pobuđuje fluorofore. Međutim, zbog izuzetno male dubine, njegov volumen će biti vrlo mali. Rezultat je niska pozadina.
Modifikacija
Fluorescentna mikroskopija zasnovana na totalnoj unutrašnjoj refleksiji može se realizovati epi-osvetljenjem. Za to su potrebna sočiva sa povećanim numeričkim otvorom blende (najmanje 1,4, ali je poželjno da dostigne 1,45-1,6), kao i djelomično osvijetljeno polje aparata. Ovo posljednje se postiže malim mjestom. Za veću ujednačenost koristi se tanak prsten kroz koji se blokira dio protoka. Da bi se dobio kritični ugao nakon kojeg dolazi do potpune refleksije, potreban je visok nivo prelamanja medija za uranjanje u sočiva i pokrovno staklo mikroskopa.
