Molekularno biološke metode istraživanja igraju veliku ulogu u modernoj medicini, forenzici i biologiji. Zahvaljujući napretku u proučavanju DNK i RNK, osoba je u mogućnosti da proučava genom organizma, odredi uzročnika bolesti, prepozna željenu nukleinsku kiselinu u mješavini kiselina, itd.
Molekularno biološke metode istraživanja. Šta je to?
U 70-im i 80-im godinama, naučnici su po prvi put uspjeli dešifrirati ljudski genom. Ovaj događaj dao je poticaj razvoju genetskog inženjeringa i molekularne biologije. Proučavanje svojstava DNK i RNK dovelo je do činjenice da je sada moguće koristiti ove nukleinske kiseline za dijagnosticiranje bolesti, proučavanje gena.
Dobivanje DNK i RNK
Molekularno-biološke dijagnostičke metode zahtijevaju prisustvo polaznog materijala: češće su to nukleinske kiseline. Postoji nekoliko načina da se ove supstance izoluju iz ćelija živih organizama. Svaki od njih ima svoje prednosti i nedostatke, i to je neophodnouzeti u obzir pri odabiru metode za izolaciju čistih nukleinskih kiselina.
1. Dobivanje DNK prema Marmuru. Metoda se sastoji u tretiranju mješavine supstanci alkoholom, zbog čega se taloži čista DNK. Nedostatak ove metode je upotreba agresivnih supstanci: fenola i kloroforma.
2. Izolacija DNK prema Boomu. Glavna supstanca koja se ovdje koristi je gvanidin tiocijanat (GuSCN). Doprinosi taloženju deoksiribonukleinske kiseline na specijalizovanim supstratima, sa kojih se može naknadno sakupiti pomoću posebnog pufera. Međutim, GuSCN je inhibitor PTC-a, pa čak i njegov mali dio koji uđe u precipitiranu DNK može utjecati na tok lančane reakcije polimeraze, koja igra važnu ulogu u radu s nukleinskim kiselinama.
3. Sedimentacija nečistoća. Metoda se razlikuje od prethodnih po tome što se ne talože molekuli deoksiribonukleinske kiseline, već nečistoće. Za to se koriste jonski izmjenjivači. Nedostatak je što se ne mogu sve tvari taložiti.
4. Masovna projekcija. Ova metoda se koristi u slučajevima kada nisu potrebne tačne informacije o sastavu molekula DNK, ali je potrebno dobiti neke statističke podatke. Ovo se objašnjava činjenicom da se struktura nukleinske kiseline može oštetiti kada se tretira deterdžentima, posebno alkalijama.
Klasifikacija istraživačkih metoda
Sve metode molekularno-biološkog istraživanja podijeljene su u tri velike grupe:
1. Amplifikacija (koristeći mnogo enzima). Evoodnosi se na PCR - lančanu reakciju polimeraze, koja igra veliku ulogu u mnogim dijagnostičkim metodama.
2. Bez pojačanja. Ova grupa metoda je direktno povezana sa radom smeša nukleinskih kiselina. Primjeri su 3 mrlje, in situ hibridizacija, itd.
3. Metode zasnovane na prepoznavanju signala iz molekula sonde koji se vezuje za DNK ili RNK specifične sonde. Primjer je Hybride Capture System (hc2).
Enzimi koji se mogu koristiti u metodama istraživanja molekularne biologije
Mnoge molekularne dijagnostičke metode uključuju upotrebu širokog spektra enzima. Ispod su najčešće korišteni:
1. Restrikcioni enzim - "siječe" DNK molekul na potrebne dijelove.
2. DNK polimeraza - sintetizira dvolančani molekul deoksiribonukleinske kiseline.
3. Reverzna transkriptaza (revertaza) - koristi se za sintetizaciju DNK na RNA šablonu.
4. DNK ligaza - odgovorna za formiranje fosfodiestarskih veza između nukleotida.
5. Egzonukleaza - uklanja nukleotide iz terminalnih dijelova molekule deoksiribonukleinske kiseline.
PCR je glavna metoda amplifikacije DNK
Lančana reakcija polimeraze (PCR) se aktivno koristi u modernoj molekularnoj biologiji. Ovo je metoda u kojoj se iz jednog molekula DNK može dobiti ogroman broj kopija (molekuli se pojačavaju).
Glavne funkcije PCR-a:
- dijagnostikabolesti;
- kloniranje DNK segmenata, gena.
Za izvođenje lančane reakcije polimeraze potrebni su sljedeći elementi: početna molekula DNK, termostabilna DNK polimeraza (Taq ili Pfu), deoksiribonukleotidni fosfati (izvori dušičnih baza), prajmeri (2 prajmera na 1 molekul DNK) i sam bafer sistem u kojem su sve reakcije moguće.
PCR se sastoji od tri koraka: denaturacija, žarenje prajmera i elongacija.
1. Denaturacija. Na temperaturi od 94-95 stepeni Celzijusa, vodonične veze između dva lanca DNK se prekidaju i kao rezultat dobijamo dva jednolančana molekula.
2. Prajmer žarenje. Na temperaturi od 50-60 stepeni Celzijusa, prajmeri se vezuju za krajeve jednolančanih molekula nukleinske kiseline po tipu komplementarnosti.
3. Izduženje. Na temperaturi od 72 stepena dolazi do sinteze ćerki dvolančanih molekula deoksiribonukleinske kiseline.
DNK sekvenciranje
Molekularno biološke metode istraživanja često zahtijevaju poznavanje nukleotidnog niza u molekulu deoksiribonukleinske kiseline. Sekvenciranje se provodi kako bi se odredio genetski kod. Molekularna dijagnostika budućnosti će se zasnivati na znanju stečenom ljudskim sekvenciranjem.
Razlikuju se sljedeće vrste sekvenciranja:
- Maxam-Gilbert sekvenciranje;
- Sanger sekvenciranje;
- pyrosequencing;
- nanoporesekvenciranje.
