Protein je esencijalna komponenta svih organizama. Svaki od njegovih molekula sastoji se od jednog ili više polipeptidnih lanaca koji se sastoje od aminokiselina. Iako su informacije neophodne za život kodirane u DNK ili RNK, rekombinantni proteini obavljaju širok spektar bioloških funkcija u organizmima, uključujući enzimsku katalizu, zaštitu, podršku, kretanje i regulaciju. Prema njihovim funkcijama u tijelu, ove tvari se mogu podijeliti u različite kategorije, kao što su antitijela, enzimi, strukturna komponenta. S obzirom na njihove važne funkcije, takvi spojevi su intenzivno proučavani i široko korišteni.
U prošlosti, glavni način za dobijanje rekombinantnog proteina bio je da se izoluje iz prirodnog izvora, što je obično neefikasno i dugotrajno. Nedavni napredak u biološkoj molekularnoj tehnologiji omogućio je kloniranje DNK koji kodira određeni skup supstanci u ekspresijski vektor za supstance kao što su bakterije, kvasac, ćelije insekata i ćelije sisara.
Jednostavno rečeno, rekombinantni proteini se prevode egzogenim DNK proizvodima užive ćelije. Njihovo dobijanje obično uključuje dva glavna koraka:
- Kloniranje molekula.
- Izraz proteina.
Trenutno je proizvodnja takve strukture jedna od najmoćnijih metoda koje se koriste u medicini i biologiji. Kompozicija ima široku primenu u istraživanju i biotehnologiji.
Medicinski smjer
Rekombinantni proteini pružaju važne tretmane za različite bolesti kao što su dijabetes, rak, zarazne bolesti, hemofilija i anemija. Tipične formulacije takvih supstanci uključuju antitijela, hormone, interleukine, enzime i antikoagulanse. Sve je veća potreba za rekombinantnim formulacijama za terapijsku upotrebu. Oni vam omogućavaju da proširite metode liječenja.
genetski modifikovani rekombinantni proteini igraju ključnu ulogu na tržištu terapijskih lijekova. Stanice sisara trenutno proizvode najviše terapeutskih sredstava jer su njihove formulacije sposobne proizvesti visokokvalitetne, prirodne supstance. Osim toga, mnogi odobreni rekombinantni terapeutski proteini se proizvode u E. coli zbog dobre genetike, brzog rasta i visoke produktivnosti. Pozitivno djeluje i na razvoj lijekova na bazi ove supstance.
Istraživanje
Dobivanje rekombinantnih proteina zasniva se na različitim metodama. Supstance pomažu u otkrivanju osnovnih i temeljnih principa tijela. Ovi molekuli se mogu koristiti za identifikaciju i određivanjelokacija supstance koju kodira određeni gen, i da se otkrije funkcija drugih gena u različitim ćelijskim aktivnostima kao što su ćelijska signalizacija, metabolizam, rast, replikacija i smrt, transkripcija, translacija i modifikacija spojeva o kojima se raspravlja u članku.
Tako se posmatrani sastav često koristi u molekularnoj biologiji, ćelijskoj biologiji, biohemiji, strukturnim i biofizičkim studijama i mnogim drugim oblastima nauke. Istovremeno, dobijanje rekombinantnih proteina je međunarodna praksa.
Takva jedinjenja su korisna sredstva u razumevanju međućelijskih interakcija. Pokazali su se efikasnim u nekoliko laboratorijskih metoda kao što su ELISA i imunohistohemija (IHC). Rekombinantni proteini se mogu koristiti za razvoj enzimskih testova. Kada se koriste u kombinaciji sa parom odgovarajućih antitela, ćelije se mogu koristiti kao standard za nove tehnologije.
Biotehnologija
Rekombinantni proteini koji sadrže sekvencu aminokiselina također se koriste u industriji, proizvodnji hrane, poljoprivredi i bioinženjeringu. Na primjer, u stočarstvu, enzimi se mogu dodati hrani kako bi se povećala nutritivna vrijednost sastojaka stočne hrane, smanjili troškovi i otpad, podržalo zdravlje crijeva životinja, poboljšala produktivnost i poboljšala okoliš.
Pored toga, bakterije mliječne kiseline (LAB) dugo vremenakorišćeni su za proizvodnju fermentisane hrane, a nedavno je razvijen LAB za ekspresiju rekombinantnih proteina koji sadrže sekvencu aminokiselina, koja se može široko koristiti, na primer, za poboljšanje probave ljudi, životinja i ishrane.
Međutim, ove supstance takođe imaju ograničenja:
- U nekim slučajevima, proizvodnja rekombinantnih proteina je složena, skupa i dugotrajna.
- Supstance proizvedene u ćelijama možda neće odgovarati prirodnim oblicima. Ova razlika može smanjiti efikasnost terapeutskih rekombinantnih proteina i čak uzrokovati nuspojave. Osim toga, ova razlika može uticati na rezultate eksperimenata.
- Glavni problem sa svim rekombinantnim lijekovima je imunogenost. Svi biotehnološki proizvodi mogu pokazati neki oblik imunogenosti. Teško je predvidjeti sigurnost novih terapijskih proteina.
Uopšteno govoreći, napredak u biotehnologiji je povećao i olakšao proizvodnju rekombinantnih proteina za različite primene. Iako još uvijek imaju neke nedostatke, supstance su važne u medicini, istraživanju i biotehnologiji.
veza za bolest
rekombinantni protein nije štetan za ljude. To je samo sastavni dio ukupne molekule u razvoju određenog lijeka ili nutritivnog elementa. Mnoge medicinske studije su pokazale da je prisilna ekspresija proteina FGFBP3 (skraćeno BP3) u laboratorijskom soju gojaznih miševa pokazala značajno smanjenje njihove tjelesne masti.mase, uprkos genetskoj predispoziciji za upotrebu.
Rezultati ovih ispitivanja pokazuju da protein FGFBP3 može ponuditi novu terapiju za poremećaje povezane s metaboličkim sindromom kao što su dijabetes tipa 2 i bolest masne jetre. Ali budući da je BP3 prirodni protein, a ne vještački lijek, klinička ispitivanja rekombinantnog humanog BP3 mogla bi početi nakon posljednje runde pretkliničkih studija. Odnosno, postoje razlozi vezani za sigurnost izvođenja ovakvih studija. Rekombinantni protein nije štetan za ljude zbog postupne obrade i pročišćavanja. Promjene se dešavaju i na molekularnom nivou.
PD-L2, jedan od ključnih igrača u imunoterapiji, nominovan je za Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu 2018. Ovaj rad, koji su započeli prof. James P. Allison iz SAD-a i prof. Tasuku Honjo iz Japana, doveo je do liječenja karcinoma poput melanoma, raka pluća i drugih na bazi imunoterapije na kontrolnim tačkama. Nedavno je AMSBIO dodao važan novi proizvod svojoj imunoterapijskoj liniji, aktivator PD-L2/TCR - CHO rekombinantna ćelijska linija.
U eksperimentima dokazivanja koncepta, istraživači sa Univerziteta Alabama u Birminghamu, predvođeni H. Long Zhengom, MD, profesorom Robertom B. Adamsom, i direktorom laboratorijske medicine, Odsjek za patologiju, UAB School of Medicina, istakli su potencijalnu terapiju rijetkog, ali fatalnog poremećaja krvarenja, TTP.
Rezultati ovogastudije po prvi put pokazuju da transfuzija trombocita napunjenih rADAMTS13 može biti nov i potencijalno efikasan terapijski pristup za arterijsku trombozu povezanu s kongenitalnom i imunološki posredovanom TTP.
Rekombinantni protein nije samo nutrijent, već i lijek u sastavu lijeka koji se razvija. Ovo je samo nekoliko oblasti koje su sada uključene u medicinu i koje se odnose na proučavanje svih njenih strukturnih elemenata. Kao što pokazuje međunarodna praksa, struktura supstance omogućava na molekularnom nivou da se nosi sa mnogim ozbiljnim problemima u ljudskom telu.
Razvoj vakcine
Rekombinantni protein je specifičan skup molekula koji se može modelirati. Slično svojstvo se koristi u razvoju vakcina. Nova strategija vakcinacije, poznata i kao upotreba specijalne injekcije rekombinantnog virusa, mogla bi zaštititi milione pilića izloženih riziku od ozbiljne respiratorne bolesti, rekli su istraživači sa Univerziteta u Edinburgu i Instituta Pirbright. Ove vakcine koriste bezopasne ili slabe verzije virusa ili bakterije da unesu klice u ćelije tela. U ovom slučaju, stručnjaci su koristili rekombinantne viruse s različitim spike proteinima kao vakcine kako bi stvorili dvije verzije bezopasnog virusa. Postoji mnogo različitih droga izgrađenih oko ove veze.
Trgovački nazivi i analozi rekombinantnih proteina su sljedeći:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Ovo su uglavnom lijekovi protiv raka, ali postoje i druga područja liječenja povezana s ovom aktivnom supstancom.
Nova vakcina, takođe nazvana LASSARAB, dizajnirana da zaštiti ljude i od Lassa groznice i od bjesnila, pokazala je obećavajuće rezultate u pretkliničkim studijama, prema novoj studiji objavljenoj u naučnom časopisu Nature Communications. Inaktivirani kandidat za rekombinantnu vakcinu koristi oslabljeni virus bjesnila.
Istraživački tim je ubacio genetski materijal Lassa virusa u vektor virusa bjesnila kako bi vakcina eksprimirala površinske proteine u Lassa i stanicama bjesnila. Ova površinska jedinjenja izazivaju imuni odgovor protiv infektivnih agenasa. Ova vakcina je potom inaktivirana da bi se "uništio" živi virus bjesnila koji je korišten za stvaranje prijenosnika.
Metode dobijanja
Postoji nekoliko sistema za proizvodnju supstance. Opšta metoda za dobijanje rekombinantnog proteina zasniva se na dobijanju biološkog materijala iz sinteze. Ali postoje i drugi načini.
Trenutno postoji pet glavnih sistema izražavanja:
- E. coli ekspresijski sistem.
- Sistem ekspresije kvasca.
- Sistem ekspresije ćelija insekata.
- Sistem ekspresije ćelija sisara.
- Sistem ekspresije proteina bez ćelija.
Potonja opcija je posebno pogodna za ekspresiju transmembranskih proteinai toksična jedinjenja. Poslednjih godina, supstance koje je teško eksprimirati konvencionalnim intracelularnim metodama uspešno su integrisane u ćelije in vitro. U Bjelorusiji se široko koristi proizvodnja rekombinantnih proteina. Brojna su državna preduzeća koja se bave ovim pitanjem.
Sistem za sintezu proteina bez ćelija je brza i efikasna metoda za sintezu ciljnih supstanci dodavanjem različitih supstrata i energetskih jedinjenja neophodnih za transkripciju i translaciju u enzimskom sistemu ćelijskih ekstrakata. Posljednjih godina, prednosti metoda bez ćelija za vrste supstanci kao što su složene, toksične membrane postepeno su se pojavile, pokazujući njihovu potencijalnu primjenu u biofarmaceutskom polju.
Tehnologija bez ćelija može lako i kontrolirano dodati razne neprirodne aminokiseline kako bi se postigli složeni procesi modifikacije koje je teško razriješiti nakon konvencionalne rekombinantne ekspresije. Takve metode imaju veliku primjenu i potencijal za isporuku lijekova i razvoj cjepiva pomoću čestica sličnih virusu. Veliki broj membranskih proteina je uspješno eksprimiran u slobodnim stanicama.
Izraz kompozicija
Rekombinantni protein CFP10-ESAT 6 se proizvodi i koristi za stvaranje vakcina. Takav alergen tuberkuloze omogućava vam da ojačate imunološki sistem i razvijete antitijela. Općenito, molekularne studije uključuju proučavanje bilo kojeg aspekta proteina, kao što su struktura, funkcija, modifikacije, lokalizacija ili interakcije. Istražitikako određene supstance regulišu unutrašnje procese, istraživači obično zahtevaju sredstva za proizvodnju funkcionalnih jedinjenja od interesa i koristi.
S obzirom na veličinu i složenost proteina, hemijska sinteza nije održiva opcija za ovaj poduhvat. Umjesto toga, žive ćelije i njihova ćelijska mašinerija se obično koriste kao fabrike za stvaranje i konstruisanje supstanci na osnovu dobijenih genetskih šablona. Sistem ekspresije rekombinantnog proteina tada stvara potrebnu strukturu za stvaranje lijeka. Slijedi izbor potrebnog materijala za različite kategorije lijekova.
Za razliku od proteina, DNK je lako konstruisati sintetički ili in vitro koristeći dobro uspostavljene rekombinantne tehnike. Stoga, DNK šabloni specifičnih gena, sa ili bez dodanih reporterskih sekvenci ili sekvenci afinitetnih oznaka, mogu biti dizajnirani kao šabloni za ekspresiju praćene supstance. Takva jedinjenja izvedena iz takvih DNK šablona nazivaju se rekombinantnim proteinima.
Tradicionalne strategije za ekspresiju supstance uključuju transfekciju ćelija sa DNK vektorom koji sadrži šablon, a zatim kultivisanje ćelija za transkribovanje i translaciju željenog proteina. Tipično, ćelije se zatim liziraju kako bi se ekstrahiralo eksprimirano jedinjenje za naknadno prečišćavanje. Rekombinantni protein CFP10-ESAT6 se obrađuje na ovaj način i prolazi kroz sistem prečišćavanja od mogućihstvaranje toksina. Tek nakon toga ide na sintetizaciju u vakcinu.
I prokariotski i eukariotski in vivo sistemi ekspresije za molekularne supstance se široko koriste. Izbor sistema zavisi od vrste proteina, zahteva za funkcionalnom aktivnošću i željenog prinosa. Ovi sistemi ekspresije uključuju sisare, insekte, kvasce, bakterije, alge i ćelije. Svaki sistem ima svoje prednosti i izazove, a odabir pravog sistema za određenu primjenu važan je za uspješno izražavanje supstance koja se razmatra.
Izraz od sisara
Upotreba rekombinantnih proteina omogućava razvoj vakcina i lekova različitih nivoa. Za to se može koristiti ovaj način dobivanja tvari. Sistemi ekspresije sisara mogu se koristiti za proizvodnju proteina iz životinjskog carstva koji imaju najnativniju strukturu i aktivnost zbog svog fiziološki relevantnog okruženja. To rezultira visokim nivoima posttranslacijske obrade i funkcionalne aktivnosti. Sistemi ekspresije sisara mogu se koristiti za proizvodnju antitela, kompleksnih proteina i jedinjenja za upotrebu u funkcionalnim testovima zasnovanim na ćelijama. Međutim, ove pogodnosti su povezane sa strožijim uslovima kulture.
Sistemi ekspresije sisara mogu se koristiti za generisanje proteina prolazno ili kroz stabilne ćelijske linije gde je ekspresioni konstrukt integrisan u genom domaćina. Iako se takvi sistemi mogu koristiti u više eksperimenata, vrijemeproizvodnja može proizvesti veliku količinu tvari za jednu do dvije sedmice. Ova vrsta rekombinantne proteinske biotehnologije je veoma tražena.
Ovi prolazni sistemi ekspresije sisara visokog prinosa koriste suspenzijske kulture i mogu dati gram po litru. Osim toga, ovi proteini imaju više prirodnog savijanja i post-translacijske modifikacije kao što je glikozilacija u poređenju sa drugim ekspresionim sistemima.
Izraz insekata
Metode za proizvodnju rekombinantnog proteina nisu ograničene na sisare. Postoje i produktivniji načini u smislu troškova proizvodnje, iako je prinos supstance po 1 litru tretirane tečnosti znatno manji.
Ćelije insekata se mogu koristiti za ekspresiju proteina visokog nivoa sa modifikacijama sličnim sistemima sisara. Postoji nekoliko sistema koji se mogu koristiti za stvaranje rekombinantnog bakulovirusa, koji se zatim može koristiti za ekstrakciju supstance od interesa u ćelijama insekata.
Izrazi rekombinantnih proteina mogu se lako povećati i prilagoditi kulturi suspenzije visoke gustine za spajanje molekula velikih razmjera. Oni su funkcionalno sličniji prirodnom sastavu materije sisara. Iako prinos može biti i do 500 mg/L, proizvodnja rekombinantnog bakulovirusa može biti dugotrajna, a uslovi uzgoja su teži od prokariotskih sistema. Međutim, u južnijim i toplijim zemljama sličnometoda se smatra efikasnijom.
Bakterijski izraz
Proizvodnja rekombinantnih proteina može se uspostaviti uz pomoć bakterija. Ova tehnologija se mnogo razlikuje od gore opisanih. Sistemi ekspresije bakterijskih proteina su popularni jer se bakterije lako uzgajaju, brzo rastu i daju visoke prinose rekombinantne formulacije. Međutim, multidomenske eukariotske supstance eksprimirane u bakterijama često su nefunkcionalne jer ćelije nisu opremljene da izvedu potrebne posttranslacijske modifikacije ili molekularno savijanje.
Pored toga, mnogi proteini postaju netopivi kao inkluzivni molekuli, koje je vrlo teško oporaviti bez oštrih denaturatora i naknadnih glomaznih molekularnih postupaka ponovnog savijanja. Ova metoda se uglavnom smatra još uvijek eksperimentalnom.
slobodni izraz ćelije
Rekombinantni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu stafilokinaze dobija se na malo drugačiji način. Uključen je u mnoge vrste injekcija, koje zahtijevaju nekoliko sistema prije upotrebe.
Ekspresija proteina bez ćelija je in vitro sinteza supstance koristeći translativno kompatibilne ekstrakte celih ćelija. U principu, ekstrakti cijelih stanica sadrže sve makromolekule i komponente potrebne za transkripciju, translaciju, pa čak i posttranslacijsku modifikaciju.
Ove komponente uključuju RNA polimerazu, regulatorne proteinske faktore, oblike transkripcije, ribozome i tRNA. Prilikom dodavanjakofaktori, nukleotidi i specifični genski šablon, ovi ekstrakti mogu sintetizirati proteine od interesa za nekoliko sati.
Iako nisu održivi za proizvodnju velikih razmera, sistemi ekspresije proteina bez ćelija ili in vitro (IVT) nude brojne prednosti u odnosu na konvencionalne in vivo sisteme.
Ekspresija bez ćelija omogućava brzu sintezu rekombinantnih formulacija bez uključivanja ćelijske kulture. Sistemi bez ćelija omogućavaju obeležavanje proteina modifikovanim amino kiselinama, kao i ekspresiju jedinjenja koja prolaze kroz brzu proteolitičku degradaciju intracelularnim proteazama. Osim toga, lakše je istovremeno eksprimirati mnogo različitih proteina koristeći metodu bez ćelija (na primjer, testiranje mutacija proteina malom ekspresijom iz mnogih različitih rekombinantnih DNK šablona). U ovom reprezentativnom eksperimentu, IVT sistem je korišten za ekspresiju humanog proteina kaspaze-3.
Zaključci i budući izgledi
Proizvodnja rekombinantnih proteina sada se može posmatrati kao zrela disciplina. Ovo je rezultat brojnih inkrementalnih poboljšanja u prečišćavanju i analizi. Trenutno se programi otkrivanja lijekova rijetko zaustavljaju zbog nemogućnosti proizvodnje ciljanog proteina. Paralelni procesi za ekspresiju, prečišćavanje i analizu nekoliko rekombinantnih supstanci danas su dobro poznati u mnogim laboratorijama širom svijeta.
Proteinski kompleksi i rastući uspjeh u izradisolubilizirane membranske strukture zahtijevat će više promjena kako bi bile u skladu sa potražnjom. Pojava djelotvornih ugovornih istraživačkih organizacija za redovniju opskrbu proteinima omogućit će preraspodjelu naučnih resursa kako bi se odgovorilo na ove nove izazove.
Pored toga, paralelni tokovi rada bi trebali omogućiti stvaranje kompletnih biblioteka praćene supstance kako bi se omogućila nova identifikacija cilja i napredni skrining, zajedno sa tradicionalnim projektima otkrivanja malih molekula lijekova.
