Za razliku od eukariota, bakterije nemaju formirano jezgro, ali njihova DNK nije raštrkana po ćeliji, već je koncentrisana u kompaktnoj strukturi zvanoj nukleoid. U funkcionalnom smislu, to je funkcionalni analog nuklearnog aparata.
Šta je nukleoid
Bakterijski nukleoid je regija u njihovim ćelijama koja sadrži strukturirani genetski materijal. Za razliku od eukariotskog jezgra, ono nije odvojeno membranom od ostatka ćelijskog sadržaja i nema trajni oblik. Uprkos tome, genetski aparat bakterija je jasno odvojen od citoplazme.
Sam izraz znači "nalik jezgru" ili "nuklearni region". Ovu strukturu je prvi otkrio 1890. zoolog Otto Buchli, ali su njene razlike u odnosu na genetski aparat eukariota identificirane već početkom 1950-ih zahvaljujući tehnologiji elektronske mikroskopije. Naziv "nukleoid" odgovara konceptu "bakterijskog hromozoma", ako se ovaj drugi nalazi u ćeliji u jednoj kopiji.
Nukleoid ne uključuje plazmide kojisu ekstrahromozomski elementi bakterijskog genoma.
Karakteristike bakterijskog nukleoida
Uobičajeno, nukleoid zauzima centralni dio bakterijske ćelije i orijentisan je duž svoje ose. Volumen ove kompaktne formacije ne prelazi 0,5 mikrona3, a molekularna težina varira od 1×109 do 3×109 d alton. U određenim tačkama, nukleoid je vezan za ćelijsku membranu.
Bakterijski nukleoid sadrži tri komponente:
- DNA.
- Strukturni i regulatorni proteini.
- RNA.
DNK ima hromozomsku organizaciju koja se razlikuje od eukariotske. Najčešće, bakterijski nukleoid sadrži jedan kromosom ili nekoliko njegovih kopija (s aktivnim rastom njihov broj doseže 8 ili više). Ovaj indikator varira ovisno o vrsti i fazi životnog ciklusa mikroorganizma. Neke bakterije imaju više hromozoma sa različitim skupovima gena.
U centru nukleoida DNK je prilično čvrsto spakovana. Ova zona je nedostupna ribozomima, enzimima replikacije i transkripcije. Naprotiv, dezoksiribonukleinske petlje periferne regije nukleoida su u direktnom kontaktu sa citoplazmom i predstavljaju aktivne regije bakterijskog genoma.
Količina proteinske komponente u bakterijskom nukleoidu ne prelazi 10%, što je oko 5 puta manje nego u eukariotskom hromatinu. Većina proteina je povezana sa DNK i učestvuje u njenom strukturiranju. RNK je proizvodtranskripcija bakterijskih gena, koja se vrši na periferiji nukleoida.
Genetski aparat bakterija je dinamička formacija sposobna da promijeni svoj oblik i strukturnu konformaciju. Nedostaju mu jezgre i mitotički aparat karakteristični za jezgro eukariotske ćelije.
Bakterijski hromozom
U većini slučajeva, bakterijski nukleoidni hromozomi imaju oblik zatvorenog prstena. Linearni hromozomi su mnogo rjeđi. U svakom slučaju, ove strukture se sastoje od jedne molekule DNK, koja sadrži skup gena neophodnih za preživljavanje bakterija.
Hromozomska DNK je kompletirana u obliku superzamotanih petlji. Broj petlji po hromozomu varira od 12 do 80. Svaki hromozom je punopravni replikon, jer se pri udvostručenju DNK u potpunosti kopira. Ovaj proces uvijek počinje od početka replikacije (OriC), koji je vezan za plazma membranu.
Ukupna dužina molekula DNK u hromozomu je nekoliko redova veličine veća od veličine bakterije, tako da postaje neophodno da je upakujemo, ali uz održavanje funkcionalne aktivnosti.
U eukariotskom hromatinu ove zadatke obavljaju glavni proteini - histoni. Bakterijski nukleoid sadrži proteine koji vežu DNK koji su odgovorni za strukturnu organizaciju genetskog materijala, a također utiču na ekspresiju gena i replikaciju DNK.
Proteini povezani s nukleoidima uključuju:
- proteini slični histonu HU, H-NS, FIS i IHF;
- topoizomeraze;
- proteini SMC porodice.
Zadnje 2 grupe imaju najveći uticaj na supersmotavanje genetskog materijala.
Neutralizaciju negativnih naboja hromozomske DNK vrše poliamini i joni magnezijuma.
Biološka uloga nukleoida
Prvenstveno, nukleoid je neophodan bakterijama za skladištenje i prenošenje naslednih informacija, kao i za njihovo sprovođenje na nivou ćelijske sinteze. Drugim riječima, biološka uloga ove formacije je ista kao i DNK.
Ostale funkcije bakterijskih nukleoida uključuju:
- lokalizacija i zbijanje genetskog materijala;
- funkcionalno DNK pakovanje;
- regulacija metabolizma.
strukturiranje DNK ne samo da omogućava molekulu da se uklopi u mikroskopsku ćeliju, već stvara i uslove za normalan tok procesa replikacije i transkripcije.
Obilježja molekularne organizacije nukleoida stvaraju uslove za kontrolu ćelijskog metabolizma promjenom konformacije DNK. Regulacija se dešava izvlačenjem određenih dijelova hromozoma u citoplazmu, što ih čini dostupnim za enzime transkripcije, ili obrnuto, uvlačenjem.
Metode detekcije
Postoje 3 načina da se vizuelno otkrije nukleoid u bakteriji:
- svetlosna mikroskopija;
- fazna kontrastna mikroskopija;
- elektronska mikroskopija.
U zavisnosti od metodepriprema preparata i metoda istraživanja, nukleoid može izgledati drugačije.
Svetlosna mikroskopija
Za detekciju nukleoida pomoću svjetlosnog mikroskopa, bakterije se preliminarno boje tako da nukleoid ima boju različitu od ostatka ćelijskog sadržaja, inače ova struktura neće biti vidljiva. Takođe je obavezno fiksirati bakterije na stakalcu (u ovom slučaju mikroorganizmi umiru).
Kroz sočivo svjetlosnog mikroskopa, nukleoid izgleda kao formacija u obliku zrna sa jasnim granicama, koja zauzima središnji dio ćelije.
Metode bojanja
U većini slučajeva, sljedeće metode bojenja bakterija se koriste za vizualizaciju nukleoida svjetlosnom mikroskopijom:
- prema Romanovsky-Giemsa;
- Felgen metoda.
Prilikom bojenja prema Romanovsky-Giemsi, bakterije se prethodno fiksiraju na staklo metil alkoholom, a zatim 10-20 minuta impregniraju bojom iz jednake mješavine azurnog, eoninskog i metilenskog plavog, rastvoren u metanolu. Kao rezultat, nukleoid postaje ljubičast, a citoplazma blijedo ružičasta. Prije mikroskopije, mrlja se ocijedi, a predmetno stakalce ispere destilatom i osuši.
Feulgen metoda koristi hidrolizu slabe kiseline. Kao rezultat toga, oslobođena deoksiriboza prelazi u aldehidni oblik i stupa u interakciju sa fuksin-sumpornom kiselinom iz Schiffovog reagensa. Kao rezultat, nukleoid postaje crven, a citoplazma plava.
Mikroskopija faznog kontrasta
Mikroskopija faznog kontrasta imaveća rezolucija od svetlosti. Ova metoda ne zahtijeva fiksiranje i bojenje preparata - promatra se na žive bakterije. Nukleoid u takvim stanicama izgleda kao svijetlo ovalno područje na pozadini tamne citoplazme. Efikasnija metoda se može napraviti primjenom fluorescentnih boja.
Detekcija nukleoida elektronskim mikroskopom
Postoje 2 načina da pripremite preparat za ispitivanje nukleoida pod elektronskim mikroskopom:
- ultra-tanki rez;
- Izrežite smrznute bakterije.
Na elektronskim mikrofotografijama ultratankog preseka bakterije, nukleoid ima izgled guste mrežne strukture koja se sastoji od tankih filamenata, koja izgleda lakša od okolne citoplazme.
Na dijelu zamrznute bakterije nakon imunološkog bojenja, nukleoid izgleda kao struktura nalik koralu sa gustom jezgrom i tankim izbočinama koje prodiru u citoplazmu.
Na elektronskim fotografijama nukleoid bakterije najčešće zauzima centralni dio ćelije i ima manji volumen nego u živoj ćeliji. To je zbog izlaganja hemikalijama koje se koriste za popravljanje preparata.
