Uzgoj bakterija: metode, principi, koraci i uslovi

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Zadnja izmjena: 2023-12-17 05:19

Mikroorganizmi u prirodi oko nas su posvuda: u zemljištu, vodenim tijelima, na površinama raznih objekata, ljudi i životinje su nastanjeni njima. Sve to može poslužiti kao izvor mikrobne kontaminacije hrane, lijekova i proizvodnih linija. Uzgoj bakterija je neophodan za proučavanje njihovih svojstava, potreba i karakteristika. Ovo je, pak, važan korak u razvoju različitih lijekova, laboratorijskoj dijagnostici bolesti, proračunu proizvodnih reaktora i još mnogo toga.

Opći koncepti

Uzgoj bakterija u mikrobiologiji se odnosi na uzgoj mikroorganizama koji se obavlja u laboratoriji. Zauzvrat, mikrobi koji su rasli na odabranom hranjivom mediju nazivaju se kultura. Kulture se mogu miješati ako su formirane od različitih vrsta mikroorganizama, a čiste ako ih predstavlja samo jedna vrsta bakterija.

Ako je nutritivnaU medijum se stavlja samo jedna ćelija, a kao rezultat njene reprodukcije dobije se grupa jedinki, tada se ovaj skup mikroorganizama naziva klon. Kada se klon razvije do tačke u kojoj postaje vidljiv golim okom, ova kolekcija bakterija naziva se kolonija.

Obično se uzgajanje bakterija izolovanih iz različitih izvora vrši odvojeno jedna od druge. Svaka takva zasebno uzgojena grupa mikroba naziva se soj. Dakle, ako je jedna vrsta stafilokoka izolirana iz tri izvora (ili različitih dijelova istog proizvoda, različitih ljudi), govori se o tri soja ove vrste stafilokoka.

Fakteri rasta bakterija

Uključuju razne aminokiseline, lipide, purinske baze i druga jedinjenja neophodna za razvoj mikroorganizama. Neki mikrobi mogu samostalno proizvesti tvari koje su im potrebne, dok ih drugi trebaju primiti u gotovom obliku. U skladu sa potrebama mikroorganizama u određenim faktorima rasta, vrši se identifikacija i diferencijacija bakterija. Takođe, ovaj parametar je važan za ispravnu pripremu hranljive podloge za laboratorijske i biotehnološke radove:

• Aminokiseline. Bakterije mogu zahtijevati jednu određenu aminokiselinu ili grupu kiselina. Dakle, klostridijama je potreban leucin i tirozin, a streptokokama leucin i arginin. Mikroorganizmi kojima su za rast potrebne aminokiseline izvana nazivaju se auksotrofi.
• Purinske i pirimidinske baze, kao i njihovi derivati (adenin, gvanin i drugi). Oni su važan faktor u rastu mnogihStreptococcus vrsta.
• Vitamini. Oni su dio koenzima potrebnih bakterijama. Dakle, nikotinska kiselina, kao i njen amid, koji su dio NAD i NADP, potrebna je difteriji i shigella corynebacterijama. Tiamin, kao sastavni dio pirofosfata, potreban je Staphylococcus aureus, pneumokoku, bruceli. Pantotenska kiselina, koja je dio koenzima CoA, potrebna je bacilima tetanusa i određenim vrstama streptokoka. Citokromi, a samim tim i folna kiselina, hemovi i biotin koji ih formiraju, neophodni su za Mycobacterium tuberculosis i Haemophilus influenzae.

Zahtjevi za okoliš

Uvjeti za podloge za uzgoj bakterija:

1. Prehrana. Moraju sadržavati tvari, osim toga, u lako svarljivom obliku, neophodne mikroorganizmima za hranjenje i obnavljanje energije. To uključuje organogene i minerale. Neki mikroorganizmi dodatno zahtijevaju vitamine i aminokiseline koje ne mogu sintetizirati.
2. Optimalni pH nivo. Utiče na propusnost ćelijske membrane i, shodno tome, na sposobnost bakterije da apsorbira hranjive tvari. Najčešće bi pH vrijednost trebala biti na nivou od 7, 2–7, 4. Mnogi mikroorganizmi u toku svog života proizvode produkte kiselih ili alkalnih reakcija, a kako se pH hranljive podloge ne bi mijenjao, mora biti baferovan.
3. Izotonični. Osmotski pritisak u hranljivoj sredini za uzgoj bakterija treba da ima iste vrednosti kaounutar mikrobnih ćelija. Obično odgovara 0,5% rastvoru NaCl.
4. Sterilnost. To je zbog činjenice da će pojava stranih bakterija iskriviti rezultate proučavanja analiziranog soja.
5. Nivo vlažnosti. Ovaj indikator, zajedno sa konzistencijom podloge, treba da ima optimalne karakteristike za određenu vrstu bakterija.
6. Redoks potencijal (RH2). Prikazuje odnos supstanci koje doniraju i prihvataju elektrone, kao i nivo zasićenosti kiseonikom hranljive sredine. Za aerobe i anaerobe, uvjeti za uzgoj bakterija se donekle razlikuju u ovom pokazatelju. Anaerobni mikroorganizmi se najbolje razmnožavaju pri vrijednostima RH2 ispod 5, a aerobni mikroorganizmi najmanje 10.
7. Uniformitet. Važno je da podloga za uzgoj sadrži konstantne količine svojih pojedinačnih sastojaka. Osim toga, preferiraju se bistra rješenja koja olakšavaju praćenje rasta usjeva ili primjećuju kontaminaciju.

Vrste kulturnih medija

Na izbor određenog medijuma za uzgoj mikroorganizama utiču mnogi faktori, među kojima su karakteristike njihove ishrane i svrha istraživanja. Glavne karakteristike koje su u osnovi klasifikacije hranljivih podloga su:

1. Komponente. Prema početnim supstancama koje se koriste za stvaranje supstrata razlikuju se:

• prirodni, koji se pripremaju od proizvoda životinjskog ili biljnog porijekla (npr. meso, mlijeko, voće) i pogodni su za uzgoj miješanihusjevi;
• polusintetički, u kojem se skupi prirodni prehrambeni proizvodi zamjenjuju neprehrambenim proizvodima (na primjer, koštano brašno, krvni ugrušci), a koji su optimalni za uzgoj određenih vrsta bakterija ili izolaciju njihovih metaboličkih proizvoda iz okruženje;
• sintetički, koji se pripremaju od preciznih količina hemijskih jedinjenja, imaju poznat konstantan sastav i lako se mogu reprodukovati.

2. Konzistencija (gustina). Razlikovanje okruženja:

• tečnost;
• gusto;
• polutečno.

Poslednja dva se pripremaju od specijalnih rastvora ili tečnih supstanci sa dodatkom agar-agara ili želatine za stvaranje potrebne gustine. Osim toga, gusto okruženje za rast bakterija je zgrušani krvni serum, krompir, silika gel podloga, karagenan.

3. Compound. Na osnovu toga, okruženja su:

• jednostavna, lista kojih je kratka je Meat Pepton Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Pepton Agar (MPA), hranjiva želatina i pepton voda.
• kompleks, pripremljen od jednostavnih sa dodatkom krvi, surutke, ugljenih hidrata i drugih supstanci.

4. Imenovanje. Razlikuju se sljedeće hranljive podloge:

• main se koriste za uzgoj mnogih patogenih mikroba (obično jednostavan sastav);
• posebne se koriste za izolaciju i kultivaciju bakterija koje ne rastu na jednostavnim podlogama;
• selektivni (takođe su selektivni) pogodni su za izolaciju specifične vrste bakterija i inhibiraju rast povezanih mikroba (selektivnostnastaje dodavanjem određenih supstanci u medije, kao što su antibiotici ili soli, ili podešavanjem pH);
• diferencijalna dijagnostika omogućava razlikovanje jedne vrste bakterija od druge procjenom enzimske aktivnosti, na primjer, medija;
• za početnu inokulaciju sa naknadnim transportom uzoraka potrebni su konzervansi, jer sprečavaju smrt mikroorganizama, kao i inhibiraju rast drugih bakterija.

Priprema medija

Najvažniji korak u uzgoju anaerobnih bakterija je priprema odgovarajuće hranljive podloge. Nakon odabira optimalnih parametara, prijeđite na sljedeće faze:

• vaganje, odabirom uzorka komponenti na analitičkoj vagi;
• otapanje se vrši u destilovanoj vodi zagrijanoj na 70°C, a fosfati, mikro- i makrosoli se odvojeno rastvaraju;
• kuhanje u vodenom kupatilu dvije minute;
• određivanje pH indikatorom papirom ili potenciometrom;
• filtracija kroz filtere od mokre tkanine ili papira za tečne, kao i rastaljene guste podloge, i kroz filter od pamučne gaze za agar podloge;
• punjenje izvršeno na 3/4 kapaciteta;
• srednje zavisna sterilizacija;
• kontrola sterilnosti vrši se odležavanjem dva dana u termostatu, nakon čega slijedi pregled;
• hemijska kontrola za utvrđivanje pH i sadržaja potrebnogstavke;
• biološka kontrola probnom inokulacijom.

Sterilizacija staklenog posuđa i medija

Jedan od osnovnih principa uzgoja bakterija je sterilnost. Rast i razvoj stranih mikroorganizama može uticati na karakteristike hranljivog medija promenom njegovog hemijskog sastava i pH vrednosti. Sterilizacija je glavni uslov za uzgoj čistih kultura. U praksi, ovaj pojam označava metode uništavanja apsolutno svih oblika života na površini iu volumenu steriliziranih predmeta. Posude, instrumenti koji se koriste, mediji i drugi predmeti korišteni tokom studije su sterilizirani.

Neke vrste sterilizacije:

• Ignition. Sterilizacija petlji i iglica za setvu, staklenih stakala, nekih instrumenata može se obaviti pomoću gorionika ili špiritusne lampe.
• Krenje. Pogodno za rukovanje špricama, iglama, hranom, ali ne ubija spore bakterija.
• Sterilizacija suvom toplotom. Izvodi se u posebnom ormaru za sušenje i pogodan je za obradu tikvica, epruveta i drugog laboratorijskog staklenog posuđa.
• Sterilizacija parom. Izvedena u autoklavu, ova metoda je vrlo efikasna. Ali nije prikladan za hranljive podloge koje sadrže proteine ili bilo koje druge spojeve koji se razgrađuju na visokim temperaturama. Štedljivija se može nazvati tindalizacijom. Izvodi se u Koch kotlu i kombinuje klijanje spora sa njihovim uništavanjem.
• Pasterizacija. Koristi se za medije koji prokuvavanjem menjaju svojstva (npr. mleko, vino, pivo), sposobne zaosloboditi ih od mikroorganizama koji ne nose spore. Temperatura obrade je samo 50-60°C u trajanju od petnaest do trideset minuta. U nekim slučajevima se koristi hladna sterilizacija, koja se vrši pomoću filtera ili UV zraka.

Uslovi uzgoja bakterija

Rast i razvoj bakterija moguć je samo pod određenim faktorima i vrijednostima svakog od njih:

1. Temperatura. Postoje tri grupe bakterija koje se razlikuju po preferencijama temperature:

• termofili, ili mikrobi koji vole toplinu, rastu na 45-90°C, što znači da se ne razmnožavaju u ljudskim i životinjskim organizmima;
• psihrofili, ili mikroorganizmi koji vole hladnoću, preferiraju temperature u rasponu od 5-15°C i uzgajaju se u hladnjačama;
• mezofili, razvijaju se na temperaturi od 25-37°C, uključuju većinu bakterija.

2. Light. To je karakteristika uzgoja fototrofnih bakterija, budući da one provode proces fotosinteze. Ali za većinu mikroba, rasvjeta nije preduvjet. Pa čak i obrnuto, solarno ultraljubičasto može suzbiti njihov razvoj.

3. Voda. Svim mikroorganizmima je potrebna voda u pristupačnom (tečnom) obliku. Zato smrznuta hrana ima mali ili nikakav rast bakterija.

4. Kiselost okoline. Ovaj princip uzgoja bakterija je već detaljno razmotren iznad.

5. Aeracija. Kiseonik je kao hemijski element sastavni deo vode i znatan broj jedinjenja za koje se koristiuzgoj mikroorganizama. Gasoviti kiseonik takođe može biti sadržan u vodi i drugim tečnostima u rastvorenom obliku. Značajnom dijelu bakterija potrebna je stalna opskrba molekulima kisika. Ali za brojne mikroorganizme to je nepotrebno, ili, još gore, plinoviti kisik je toksičan za njih, jer nemaju katalazu i peroksidazu, koje uništavaju toksične respiratorne produkte. Stoga je najvažniji korak u uzgoju anaerobnih bakterija uklanjanje O₂ molekula iz hranljive podloge.

6. Uzgoj mikroorganizama. Uzgoj aerobnih i anaerobnih bakterija vrši se u različitim slojevima životne sredine i na različite načine.

Uzgoj aerobnih mikroorganizama

Uzgoj aerobnih bakterija zahteva molekularni kiseonik. Za dobijanje čistih kultura aeroba koje se mogu uspešno koristiti u medicini i prehrambenoj industriji, koriste se sledeće metode:

• površina koja raste na gustom mediju ili u tečnom mediju (njihov tanak sloj) kada kiseonik dolazi direktno iz vazduha;
• duboka kultivacija u tečnim podlogama, kada se konstantnim prozračivanjem postiže povećanje količine kiseonika rastvorenog u njima.

Uzgoj anaerobnih mikroorganizama

Osnovni princip uzgoja bakterija ove vrste je njihov minimalni kontakt sa atmosferskim kiseonikom. Osigurati uslove za njihov rast je mnogo teže nego za aerobne. Sljedeće metode se koriste za izolaciju anaeroba iz molekularnog O₂:

1. Fizički. Ova metoda uzgoja anaerobnih bakterija svodi se na njihovu kultivaciju u posebnom vakuum aparatu - mikroanaerostatu. Vazduh u njemu je zamenjen specijalnom gasnom mešavinom azota sa dodatkom 10% vodonika i 5% ugljen-dioksida.
2. Chemical. To uključuje: upotrebu upijajućih sredstava (npr. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ili reduktori (kao što je askorbinska kiselina).
3. Biološka. Svodi se na kokultivaciju aerobnih i anaerobnih vrsta u zatvorenom sistemu. Ova metoda uzgoja bakterija podrazumijeva zasijavanje jedne polovice Petrijeve posude nekom od aerobnih vrsta bakterija, a druge polovice proučavanim anaerobom. Njegov razvoj će početi u trenutku kada se potroši sav kiseonik.

Sljedeće metode sjetve su pogodne za uzgoj anaerobnih bakterija:

• u površinskom sloju;
• u površinskom sloju ispunjenom sterilnim parafinom;
• u gustom hranljivom mediju;
• u dubokim slojevima viskoznih medija.

Dobijanje čiste kulture

Mikrobiolozi obično rade sa uzorcima u kojima živi mnogo različitih vrsta mikroba. Međutim, za određivanje sistematskog položaja mikroorganizama (porodica, rod, vrsta), kao i za proučavanje njihovih karakteristika, potrebno ih je izolovati i uzgajati čistu kulturu. Oni su od velikog značaja u mnogim prehrambenim industrijama, na primer, sir, hleb, kvas, vino itd. Uzgoj bakterija mlečne kiseline omogućava dobijanjebitna komponenta za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda, tijesta, kakaa, silaže pa čak i plastike.

Metoda izolacije čiste kulture u gustom mediju zasniva se na mehaničkom odvajanju ćelija mikroorganizama sa njihovom naknadnom izolovanom kultivacijom. Uzorak se prebacuje u sterilnu zapreminu vode ili fiziološkog rastvora (zapremina 10-100 ml), a zatim se mućka dve minute. Da bi se izdvojili mikroorganizmi koji se nalaze u debljini ispitivanog materijala (na primjer, kobasice ili sir), prvo se vrši trljanje komada uzorka sterilnim instrumentima s pijeskom. Materijal koji je prošao preliminarnu pripremu, težine 1 g ili zapremine od 1 ml, razrjeđuje se sterilnom vodom 10, 100, 1000, itd. puta. Odabire se stepen razblaženja koji daje koncentraciju ćelija koja odgovara mogućnostima metode.

Naknadna kultivacija mikroorganizama je priprema hranljive podloge. Obično se bira gusti medij (MPA). Prvo se topi i ohladi na 45-50 °C, a tek onda se sipa u nekoliko Petrijevih posuda (tri do pet komada), na čije se dno stavljaju brisevi ispitivane supstance različite koncentracije. Zatim se vrši miješanje još nezamrznutog hranjivog medija i materijala koji se u njega unosi. Ovako se ćelije fiksiraju na različitim tačkama zapremine supstrata.

Dalje, Petrijeve zdjelice se stavljaju u termostat na 2 dana na 22 °C. Za to vrijeme ćelije se umnožavaju do te mjere da kolonija koju formira svaka od stanica postaje vidljiva golim okom. Svaka od njih je čista kultura vrste bakterija iz čijih je ćelijaruža.

Nakon toga, iz Petrijevih zdjela, mikroorganizmi se subkulturiraju u zasebne epruvete napunjene hranljivim podlogom. Na ovaj način se čiste kulture izoluju iz miješanog uzorka. Ova metoda nosi ime svog programera - R. Koch. Uobičajeno se naziva i metodom čaše, ili osiromašenjem. Nakon dobijanja čistih kultura različitih vrsta bakterija, određuju se njihov oblik, spore i porodice.

Svi radovi moraju biti obavljeni u skladu sa principima asepse. Kako bi se izbjegao prerani razvoj mikroorganizama, ispitivanje treba provesti odmah nakon uzorkovanja. Voda iz slavine se analizira nakon ispuštanja prvih porcija, jer mogu sadržavati mikrobe nakupljene u cijevima i slavinama. Mikroflora voća, bobičastog voća i povrća uglavnom se nalazi na površini (kora), pa se s nje vrše ispiranje. Da biste to učinili, stavite fetus u sterilnu posudu i napunite je potrebnom količinom vode. Zatim se prilično snažno protresu i voda se sipa u drugu posudu. U brisevima se dobijaju i usevi od platnenih proizvoda, ali se prethodno iz njih izrezuju komadi zadate veličine.