Mikroskopske metode istraživanja su metode proučavanja raznih objekata uz pomoć posebne opreme. Omogućava nam da razmotrimo strukturu supstanci i organizama, čija veličina je izvan rezolucije ljudskog oka. U članku ćemo ukratko analizirati mikroskopske metode istraživanja.
Opće informacije
Savremene metode mikroskopskog pregleda u svojoj praksi koriste različiti stručnjaci. Među njima su virolozi, citolozi, hematolozi, morfologi i drugi. Glavne metode mikroskopskog pregleda poznate su dugo vremena. Prije svega, ovo je lagana metoda gledanja objekata. Posljednjih godina druge tehnologije se aktivno uvode u praksu. Tako su popularnost stekle fazno-kontrastne, luminescentne, interferentne, polarizacijske, infracrvene, ultraljubičaste, stereoskopske metode istraživanja. Svi su zasnovani na različitim svojstvima. Sveta. Osim toga, široko se koriste metode elektronskog mikroskopskog istraživanja. Ove metode vam omogućavaju da prikažete objekte koristeći usmjereni tok nabijenih čestica. Treba napomenuti da se takve metode proučavanja koriste ne samo u biologiji i medicini. Mikroskopska metoda proučavanja metala i legura u industriji je prilično popularna. Takva studija omogućava procjenu ponašanja zglobova, razvoj tehnologija za smanjenje vjerovatnoće kvara i povećanje snage.
Svjetli načini: karakteristike
Ovakve mikroskopske metode za proučavanje mikroorganizama i drugih objekata baziraju se na različitim rezolucijama opreme. Važni faktori u ovom slučaju su smjer snopa, karakteristike samog objekta. Potonji, posebno, mogu biti providni ili neprozirni. U skladu sa svojstvima objekta, mijenjaju se fizička svojstva svjetlosnog toka - svjetlina i boja, zbog amplitude i talasne dužine, ravni, faze i pravca širenja talasa. Različite metode mikroskopskog istraživanja zasnovane su na korištenju ovih karakteristika.
Specifičnosti
Za proučavanje svjetlosnim metodama, objekti se obično slikaju. Ovo vam omogućava da identifikujete i opišete određena njihova svojstva. To zahtijeva da se tkiva fiksiraju, jer će bojenje otkriti određene strukture samo u ubijenim stanicama. U živim ćelijama, boja se izoluje kao vakuola u citoplazmi. Ne farba strukture. Ali uz pomoć svjetlosnog mikroskopa mogu se ispitati i živi objekti. Za to se koristi vitalna metoda proučavanja. U takvim slučajevima koristi se kondenzator tamnog polja. Ugrađen je u svjetlosni mikroskop.
Proučavanje neobojenih objekata
Obavlja se fazno-kontrastnom mikroskopom. Ova metoda se zasniva na difrakciji zraka u skladu sa karakteristikama objekta. U procesu izlaganja primjećuje se promjena faze i talasne dužine. U objektivu mikroskopa nalazi se prozirna ploča. Živi ili fiksni, ali neobojeni objekti, zbog svoje prozirnosti, gotovo ne mijenjaju boju i amplitudu zraka koji prolazi kroz njih, izazivajući samo pomak u fazi vala. Ali u isto vrijeme, prošavši kroz objekt, svjetlosni tok odstupa od ploče. Kao rezultat toga, između zraka koje prolaze kroz objekt i ulaze u svijetlu pozadinu, pojavljuje se razlika u talasnoj dužini. Pri određenoj vrijednosti dolazi do vizualnog efekta - tamni predmet će biti jasno vidljiv na svijetloj pozadini, ili obrnuto (u skladu sa karakteristikama fazne ploče). Da biste ga dobili, razlika mora biti najmanje 1/4 talasne dužine.
Anoptralna metoda
To je vrsta fazno-kontrastne metode. Anoptralna metoda uključuje korištenje sočiva sa posebnim pločama koje mijenjaju samo boju i svjetlinu pozadinskog svjetla. Ovo značajno proširuje mogućnosti proučavanja neobojenih živih objekata. Fazno-kontrastna mikroskopska metoda istraživanja koristi se u mikrobiologiji, parazitologiji u proučavanju biljnih i životinjskih ćelija,najjednostavniji organizmi. U hematologiji se ova metoda koristi za izračunavanje i određivanje diferencijacije elemenata krvi i koštane srži.
Tehnike interferencije
Ove mikroskopske metode istraživanja uglavnom rješavaju iste probleme kao i fazno-kontrastne. Međutim, u potonjem slučaju, stručnjaci mogu promatrati samo konture objekata. Mikroskopske metode istraživanja interferencije omogućavaju vam da proučavate njihove dijelove, da izvršite kvantitativnu procjenu elemenata. To je moguće zbog bifurkacije svjetlosnog snopa. Jedan tok prolazi kroz česticu objekta, a drugi prolazi. U okularu mikroskopa oni se konvergiraju i interferiraju. Rezultirajuća fazna razlika može se odrediti masom različitih ćelijskih struktura. Uzastopnim mjerenjem sa zadatim indeksima prelamanja moguće je odrediti debljinu nefiksiranih tkiva i živih objekata, sadržaj proteina u njima, koncentraciju suhe tvari i vode itd. U skladu sa dobijenim podacima, stručnjaci su može indirektno procijeniti propusnost membrane, aktivnost enzima i ćelijski metabolizam.
Polarizacija
Izvodi se pomoću Nicol prizmi ili filmskih polaroida. Postavljaju se između lijeka i izvora svjetlosti. Metoda polarizacijskog mikroskopskog istraživanja u mikrobiologiji omogućava proučavanje objekata s nehomogenim svojstvima. U izotropnim strukturama, brzina prostiranja svjetlosti ne ovisi o odabranoj ravni. U ovom slučaju, u anizotropnim sistemima, brzina se menja u skladu sausmjerenost svjetlosti duž poprečne ili uzdužne ose objekta. Ako je veličina prelamanja duž strukture veća nego duž poprečne, stvara se dvostruka pozitivna refrakcija. Ovo je karakteristično za mnoge biološke objekte koji imaju strogu molekularnu orijentaciju. Svi su anizotropni. Ova kategorija posebno uključuje miofibrile, neurofibrile, cilije u cilijarnom epitelu, kolagena vlakna i druge.
Vrijednost polarizacije
Poređenje prirode prelamanja zraka i indeksa anizotropije objekta omogućava procjenu molekularne organizacije strukture. Metoda polarizacije djeluje kao jedna od histoloških metoda analize, koristi se u citologiji itd. Ne samo da se obojeni objekti mogu proučavati na svjetlu. Metoda polarizacije omogućava proučavanje neobojenih i nefiksiranih - nativnih - preparata presjeka tkiva.
Luminescentni trikovi
Zasnovane su na svojstvima nekih objekata da daju sjaj u plavo-ljubičastom dijelu spektra ili u UV zracima. Mnoge supstance, kao što su proteini, neki vitamini, koenzimi, lekovi, obdareni su primarnom (intrinzičnom) luminiscencijom. Drugi objekti počinju da sijaju kada se dodaju fluorohromi, specijalne boje. Ovi aditivi se selektivno ili difuzno šire na pojedinačne ćelijske strukture ili hemijska jedinjenja. Ovo svojstvo predstavljalo je osnovu za upotrebu luminiscentne mikroskopije za histohemijske icitološke studije.
Područja korištenja
Koristeći imunofluorescenciju, stručnjaci otkrivaju virusne antigene i određuju njihovu koncentraciju, identifikuju viruse, antitijela i antigene, hormone, razne metaboličke produkte itd. S tim u vezi, u dijagnostici herpesa, zaušnjaka, virusnog hepatitisa, gripe i drugih infekcija koriste se luminiscentne metode za ispitivanje materijala. Metoda mikroskopske imunofluorescencije omogućava prepoznavanje malignih tumora, određivanje ishemijskih područja u srcu u ranim fazama srčanog udara, itd.
Upotreba ultraljubičastog svjetla
Zasniva se na sposobnosti brojnih supstanci uključenih u žive ćelije, mikroorganizme ili fiksna, ali neobojena, vidljivo-svetlo prozirna tkiva da apsorbuju UV zrake određene talasne dužine. Ovo je tipično, posebno, za makromolekularna jedinjenja. To uključuje proteine, aromatične kiseline (metilalanin, triptofan, tirozin, itd.), nukleinske kiseline, piramidalne i purinske baze, itd. Ultraljubičasta mikroskopija omogućava da se razjasni lokalizacija i količina ovih spojeva. Prilikom proučavanja živih objekata, stručnjaci mogu uočiti promjene u njihovim životnim procesima.
Extra
Infracrvena mikroskopija se koristi za proučavanje objekata koji su neprozirni za svjetlost i UV zrake apsorbirajući ihprotočne strukture čija je talasna dužina 750-1200 nm. Za primenu ove metode nema potrebe da se preparati prethodno izlažu hemijskoj obradi. Infracrvena metoda se po pravilu koristi u antropologiji, zoologiji i drugim biološkim oblastima. Što se tiče medicine, ova metoda se uglavnom koristi u oftalmologiji i neuromorfologiji. Proučavanje volumetrijskih objekata provodi se pomoću stereoskopske mikroskopije. Dizajn opreme omogućava vam da promatrate lijevim i desnim okom pod različitim uglovima. Neprozirni objekti se ispituju pri relativno malom uvećanju (ne više od 120 puta). Stereoskopske metode se koriste u mikrohirurgiji, patomorfologiji i sudskoj medicini.
Elektronska mikroskopija
Koristi se za proučavanje strukture ćelija i tkiva na makromolekularnom i subćelijskom nivou. Elektronska mikroskopija je omogućila da se napravi kvalitativni iskorak u polju istraživanja. Ova metoda se široko koristi u biohemiji, onkologiji, virologiji, morfologiji, imunologiji, genetici i drugim industrijama. Značajno povećanje rezolucije opreme osigurava protok elektrona koji prolaze u vakuumu kroz elektromagnetna polja. Potonje, pak, stvaraju posebna sočiva. Elektroni imaju sposobnost da prolaze kroz strukture objekta ili da se reflektuju od njih sa devijacijama pod različitim uglovima. Kao rezultat, kreira se prikaz na luminiscentnom ekranu instrumenta. Transmisionom mikroskopijom dobija se planarna slika, sa skeniranjem, odnosno volumetrijska.
Neophodni uslovi
Vrijedi napomenuti da se prije podvrgavanja elektronskom mikroskopskom pregledu predmet posebno priprema. Posebno se koristi fizička ili hemijska fiksacija tkiva i organizama. Materijal za preseke i biopsiju se, osim toga, dehidrira, ugrađuje u epoksidne smole, seče dijamantskim ili staklenim noževima u ultratanke rezove. Zatim se suprotstavljaju i proučavaju. U skenirajućem mikroskopu se ispituju površine objekata. Da bi to učinili, prskaju se posebnim supstancama u vakuumskoj komori.
