Koncept imobilizovanih enzima prvi put se pojavio u drugoj polovini 20. veka. U međuvremenu, davne 1916. godine otkriveno je da je saharoza sorbirana na ugljiku zadržala svoju katalitičku aktivnost. Godine 1953. D. Schleit i N. Grubhofer izveli su prvo vezivanje pepsina, amilaze, karboksipeptidaze i RNKaze sa nerastvorljivim nosačem. Koncept imobiliziranih enzima je legaliziran 1971. godine. To se dogodilo na prvoj konferenciji o inženjerskoj enzimologiji. Trenutno se koncept imobiliziranih enzima razmatra u širem smislu nego što je to bio na kraju 20. stoljeća. Pogledajmo pobliže ovu kategoriju.
Opće informacije
Imobilisani enzimi su jedinjenja koja su veštački vezana za nerastvorljiv nosač. Međutim, oni zadržavaju svoja katalitička svojstva. Trenutno se ovaj proces razmatra u dva aspekta - u okviru djelomičnog i potpunog ograničenja slobode kretanja proteinskih molekula.
Dostojanstvo
Naučnici su utvrdili određene prednosti imobiliziranih enzima. Djelujući kao heterogeni katalizatori, lako se mogu odvojiti od reakcionog medija. U sklopu istraživanja ustanovljeno je da se upotreba imobiliziranih enzima može ponoviti. Tokom procesa vezivanja, veze mijenjaju svoja svojstva. Oni stiču specifičnost i stabilnost supstrata. Istovremeno, njihova aktivnost počinje ovisiti o uvjetima okoline. Imobilizirani enzimi su izdržljivi i imaju visok stepen stabilnosti. Veći je od, na primjer, slobodnih enzima za hiljade, desetine hiljada puta. Sve to osigurava visoku efikasnost, konkurentnost i ekonomičnost tehnologija u kojima su prisutni imobilizirani enzimi.
Mediji
J. Poratu je identificirao ključna svojstva idealnih materijala koji će se koristiti u imobilizaciji. Nosioci moraju imati:
- Nerastvorljivost.
- Visoka biološka i hemijska otpornost.
- Mogućnost brzog aktiviranja. Nosači bi trebali lako postati reaktivni.
- Značajna hidrofilnost.
- Neophodna propusnost. Njegov indikator bi trebao biti podjednako prihvatljiv i za enzime i za koenzime, produkte reakcije i supstrate.
Trenutno ne postoji materijal koji u potpunosti ispunjava ove zahtjeve. Ipak, u praksi se koriste nosači koji su pogodni za imobilizaciju.određena kategorija enzima pod određenim uslovima.
Klasifikacija
U zavisnosti od njihove prirode, materijali, u vezi sa kojima se jedinjenja pretvaraju u imobilizovane enzime, dele se na neorganske i organske. Vezivanje mnogih spojeva se vrši pomoću polimernih nosača. Ovi organski materijali su podijeljeni u 2 klase: sintetički i prirodni. U svakom od njih, zauzvrat, razlikuju se grupe ovisno o strukturi. Neorganski nosači su uglavnom predstavljeni materijalima od stakla, keramike, gline, silika gela i grafitne crne. Pri radu s materijalima popularne su metode suhe kemije. Imobilizirani enzimi se dobijaju oblaganjem nosača filmom od titanijuma, aluminijuma, cirkonijuma, hafnijuma oksida ili obradom organskim polimerima. Važna prednost materijala je lakoća regeneracije.
Nosači proteina
Najpopularniji su lipidni, polisaharidni i proteinski materijali. Među potonjima, vrijedi istaknuti strukturne polimere. To prvenstveno uključuje kolagen, fibrin, keratin i želatin. Takvi proteini su široko rasprostranjeni u prirodnom okruženju. Oni su pristupačni i ekonomični. Osim toga, imaju veliki broj funkcionalnih grupa za vezivanje. Proteini su biorazgradivi. To omogućava proširenje upotrebe imobiliziranih enzima u medicini. U međuvremenu, proteini takođe imaju negativna svojstva. Nedostaci upotrebe imobiliziranih enzima na proteinskim nosačima su visoka imunogenost ovih potonjih, kao imogućnost uvođenja samo određenih grupa njih u reakcije.
Polisaharidi, aminosaharidi
Od ovih materijala najčešće se koriste hitin, dekstran, celuloza, agaroza i njihovi derivati. Da bi polisaharidi bili otporniji na reakcije, njihovi linearni lanci su umreženi epiklorohidrinom. Različite ionogene grupe se slobodno uvode u mrežne strukture. Hitin se akumulira u velikim količinama kao otpad tokom industrijske prerade škampa i rakova. Ova supstanca je otporna na kemikalije i ima dobro definiranu poroznu strukturu.
Sintetički polimeri
Ova grupa materijala je veoma raznolika i pristupačna. Uključuje polimere na bazi akrilne kiseline, stirena, polivinil alkohola, poliuretana i poliamidnih polimera. Većina ih je mehanički jaka. U procesu transformacije daju mogućnost variranja veličine pora u prilično širokom rasponu, uvodeći različite funkcionalne grupe.
Metode vezivanja
Trenutno postoje dvije fundamentalno različite opcije za imobilizaciju. Prvi je da se dobiju jedinjenja bez kovalentnih veza sa nosačem. Ova metoda je fizička. Druga opcija uključuje pojavu kovalentne veze sa materijalom. Ovo je hemijska metoda.
Adsorpcija
Uz pomoć njega se imobilizirani enzimi dobijaju držanjem lijeka na površini nosača zbogdisperzije, hidrofobne, elektrostatičke interakcije i vodikove veze. Adsorpcija je bila prvi način da se ograniči mobilnost elemenata. Međutim, ni sada ova opcija nije izgubila na važnosti. Štaviše, adsorpcija se smatra najčešćim metodom imobilizacije u industriji.
Karakteristike metode
Naučne publikacije opisuju više od 70 enzima dobijenih metodom adsorpcije. Nosači su uglavnom bili porozno staklo, razne gline, polisaharidi, aluminijski oksidi, sintetički polimeri, titan i drugi metali. Potonji se najčešće koriste. Efikasnost adsorpcije lijeka na nosaču određena je poroznošću materijala i specifičnom površinom.
Mehanizam djelovanja
Adsorpcija enzima na nerastvorljivim materijalima je jednostavna. Postiže se kontaktom vodene otopine lijeka s nosačem. Može proći na statički ili dinamički način. Otopina enzima se miješa sa svježim sedimentom, na primjer, titan hidroksidom. Jedinjenje se zatim suši pod blagim uslovima. Aktivnost enzima tokom takve imobilizacije zadržava se skoro 100%. Istovremeno, specifična koncentracija dostiže 64 mg po gramu nosača.
Negativni trenuci
Nedostaci adsorpcije uključuju nisku snagu pri vezivanju enzima i nosača. U procesu promjene uvjeta reakcije može se uočiti gubitak elemenata, kontaminacija proizvoda i desorpcija proteina. Za poboljšanje snagenosioci vezivanja su unapred modifikovani. Posebno se materijali tretiraju ionima metala, polimerima, hidrofobnim spojevima i drugim polifunkcionalnim agensima. U nekim slučajevima, sam lijek je modificiran. Ali vrlo često to dovodi do smanjenja njegove aktivnosti.
Uključivanje u gel
Ova opcija je prilično česta zbog svoje jedinstvenosti i jednostavnosti. Ova metoda je prikladna ne samo za pojedinačne elemente, već i za komplekse s više enzima. Ugradnja u gel može se izvršiti na dva načina. U prvom slučaju, lijek se kombinira s vodenom otopinom monomera, nakon čega se vrši polimerizacija. Kao rezultat, pojavljuje se prostorna struktura gela koja sadrži molekule enzima u stanicama. U drugom slučaju, lijek se unosi u otopinu gotovog polimera. Zatim se stavlja u gel stanje.
Upad u prozirne strukture
Suština ove metode imobilizacije je odvajanje vodene otopine enzima od supstrata. Za to se koristi polupropusna membrana. Omogućava prolazak elemenata niske molekularne težine kofaktora i supstrata i zadržava velike molekule enzima.
Mikrokapsulacija
Postoji nekoliko opcija za ugradnju u prozirne strukture. Od njih, mikrokapsulacija i inkorporacija proteina u liposome su od najvećeg interesa. Prvu opciju je 1964. predložio T. Chang. Sastoji se od činjenice da se otopina enzima unosi u zatvorenu kapsulu čiji su zidovi napravljeni od polupropusnihpolimer. Pojava membrane na površini uzrokovana je reakcijom međufazne polikondenzacije spojeva. Jedan od njih je otopljen u organskoj, a drugi - u vodenoj fazi. Primjer je formiranje mikrokapsule dobivene polikondenzacijom halida sebacinske kiseline (organska faza) i heksametilendiamina-1, 6 (odnosno vodene faze). Debljina membrane se izračunava u stotim dijelovima mikrometra. Veličina kapsula je stotine ili desetine mikrometara.
Ugradnja u liposome
Ova metoda imobilizacije je bliska mikrokapsulaciji. Liposomi su predstavljeni u lamelarnim ili sfernim sistemima lipidnih dvoslojeva. Ova metoda je prvi put korišćena 1970. Za izolaciju liposoma iz rastvora lipida, organski rastvarač se isparava. Preostali tanki film se raspršuje u vodenoj otopini u kojoj je enzim prisutan. Tokom ovog procesa dolazi do samosastavljanja lipidnih dvoslojnih struktura. Takvi imobilizirani enzimi su prilično popularni u medicini. To je zbog činjenice da je većina molekula lokalizirana u lipidnom matriksu bioloških membrana. Imobilizirani enzimi uključeni u liposome su najvažniji istraživački materijal u medicini, koji omogućava proučavanje i opisivanje obrazaca vitalnih procesa.
Formiranje novih obveznica
Imobilizacija formiranjem novih kovalentnih lanaca između enzima i nosača smatra se najrasprostranjenijom metodom za dobijanje industrijskih biokatalizatora.odredište. Za razliku od fizičkih metoda, ova opcija pruža nepovratnu i jaku vezu između molekula i materijala. Njegovo formiranje često je praćeno stabilizacijom lijeka. Istovremeno, lokacija enzima na udaljenosti 1. kovalentne veze u odnosu na nosač stvara određene poteškoće u provedbi katalitičkog procesa. Molekul je odvojen od materijala pomoću umetka. Često se koristi kao poli- i bifunkcionalna sredstva. Konkretno, to su hidrazin, cijanogen bromid, glutarni diahedrid, sulfuril hlorid, itd. Na primjer, da bi se uklonila galaktoziltransferaza, sljedeća sekvenca se ubacuje između nosača i enzima -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. U takvoj situaciji u strukturi su prisutni umetak, molekul i nosač. Svi su povezani kovalentnim vezama. Od fundamentalnog značaja je potreba da se u reakciju uvedu funkcionalne grupe koje nisu bitne za katalitičku funkciju elementa. Dakle, u pravilu se glikoproteini vezuju za nosač ne preko proteina, već preko ugljikohidratnog dijela. Kao rezultat, dobijaju se stabilniji i aktivniji imobilizirani enzimi.
Ćelije
Gore opisane metode smatraju se univerzalnim za sve vrste biokatalizatora. To uključuje, između ostalog, ćelije, supćelijske strukture, čija je imobilizacija nedavno postala raširena. To je zbog sljedećeg. Kada su ćelije imobilizovane, nema potrebe za izolacijom i prečišćavanjem enzimskih preparata ili uvođenjem kofaktora u reakcije. Kao rezultat, postaje moguće da sesistemi koji izvode višestepene kontinuirane procese.
Upotreba imobiliziranih enzima
U veterinarskoj medicini, industriji i drugim privrednim sektorima, lijekovi dobiveni gore navedenim metodama su prilično popularni. Pristupi razvijeni u praksi daju rješenje za probleme ciljane dostave lijekova u organizam. Imobilizirani enzimi omogućili su dobivanje lijekova produženog djelovanja uz minimalnu alergenost i toksičnost. Trenutno naučnici rješavaju probleme povezane s biokonverzijom mase i energije koristeći mikrobiološke pristupe. U međuvremenu, tehnologija imobiliziranih enzima također daje značajan doprinos radu. Izgleda da su izgledi za razvoj prilično široki. Dakle, u budućnosti bi jedna od ključnih uloga u procesu praćenja stanja životne sredine trebala imati nove vrste analiza. Konkretno, govorimo o metodama bioluminiscentnih i enzimskih imunoanaliza. Napredni pristupi su od posebnog značaja u preradi lignoceluloznih sirovina. Imobilizirani enzimi se mogu koristiti kao pojačivači slabih signala. Aktivni centar može biti pod uticajem nosioca koji je pod ultrazvukom, mehaničkim stresom ili podložan fitokemijskim transformacijama.
