U diferencijalnom određivanju enterobakterija i nekih vibrija, Voges-Proskauerova reakcija zauzima posebno mjesto. Test se zasniva na sposobnosti bakterija da fermentiraju glukozu u acetoin.
Suština istraživačkog procesa
U mikrobiologiji, Voges-Proskauerova reakcija se često koristi za razlikovanje unutar Yersinia porodice enterobakterija (uključujući patogene pseudotuberkuloze i enterokolitisa), Escherichia coli i aeroba koji stvaraju spore. Rezultat se vizualizira bojenjem medija kada se dodaju određeni reagensi.
Ovaj test pripada IMViC seriji (skraćenica od Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - grupi identifikacijskih testova uključujući diferencijalne definicije:
- sa indolom, zasnovan na razgradnji triptofana u indol, koji se koristi u prisustvu Kovacsovog ili Ehrlichovog reagensa;
- koristećimetilrot, ili metil crveno, koji detektuje dati pH kao rezultat metabolizma glukoze;
- Voges-Proskauer reakcije za detekciju acetil-metilkarbinola;
- iskorištenje citrata sa promjenom boje kao rezultat alkalizacije medija.
Suština procesa je vizualizacija prisustva dijagnostikovanih bakterija zbog interakcije acetoina nastalog od njih sa kaustičnom potašom u prisustvu kiseonika. Acetil-metilkarbinol se oksidira u diacetil, koji formira svijetlo crveno ili ružičasto jedinjenje. Povećajte osjetljivost testa uvođenjem alfa-naftola prije dodavanja kaustične potaše.
Probna postavka
Formulacija Voges-Proskauerove reakcije uključuje preliminarnu kultivaciju mikroorganizama. Čista kultura se sije na Clarkovu diferencijalnu dijagnostičku podlogu, čija je varijacija Clarkov bujon (bez dodatka agar-agara). Koristi se ili gotov medij ili se priprema samostalno. Sastojci uključuju:
- 5g peptona;
- 5g glukoze;
- 5g dvobaznog kalijevog fosfata;
- 1L destilata.
Tokom studije, kultura se inokulira sterilnom bakteriološkom petljom u tečni medij. Količina - 5 ml u epruveti plus kontrola. Inkubacija se vrši na temperaturi od 35-37 stepeni dva dana. Zatim se provodi studija Voges-Proskauerove reakcije u fazama:
- 2, 5 ml bujonske kulture se prebacuje u sterilnu epruvetu.
- Dodajte šest kapi alfa-naftola (5% rastvor alkohola).
- Dodaj 40%rastvor kaustičnog kalijuma u količini od 0,1 ml ili dve kapi.
- Mješanje se vrši laganim protresanjem epruvete.
- Procijenite rezultat nakon 15 minuta od početka eksperimenta.
Alternativna metoda testiranja je inkubacija preko noći, čije se vrijeme smanjuje na 18 sati ili do jedan dan. Osim ove metode, koristi se i ekspresni test: kultura se u petlju unese u 2 ml podloge, inkubira oko četiri sata, zatim se dodaju reagensi u jednakoj količini od 2-3 kapi, pomiješaju i rezultat se procjenjuje nakon deset minuta.
Kontrola je jedan od uzročnika pneumonije Klebsiella pneumoniae - soj atcc 13883.
Procjena rezultata
Nakon potrebnog vremena nakon dodavanja reagensa (od 5 do 15 minuta) treba uočiti trešnja-crvenu boju sa izraženom pozitivnom reakcijom, crvenu i ružičastu - sa slabom pozitivnom reakcijom. Nijedna promjena se ne bilježi kao negativan rezultat.
Višak kaustične potaše u otopini može dati imitaciju pozitivne reakcije, bojenje u bakrenu boju. U tom slučaju, negativan odgovor testirane kolonije treba zabilježiti. Takođe, bojenje bakra se pojavljuje u slučajevima kada se procjena daje sat vremena nakon uvođenja reagensa.
Prilikom evaluacije rezultata mora se uzeti u obzir da produžena kultivacija ispitivanih mikroorganizama (više od tri dana) dovodi do zakiseljavanja podloge, što može dovesti do pogrešnog ishoda istraživanja. Reakcija može biti blago pozitivna ililažno negativan.
Zahtjevi za test reagense
Voges-Proskauer reagensi moraju ispunjavati zahtjeve kao što su ispravna koncentracija, visoka čistoća i stabilnost, što se postiže pravilnim skladištenjem.
Ketovi za testiranje spremni za upotrebu obično sadrže reagense za 100 ili više upotreba i dolaze u plastičnim ili zatamnjenim staklenim bočicama. Kvalitet je regulisan relevantnom dokumentacijom.
