Kada se proučavaju supstance u organskoj hemiji, koristi se više od deset različitih kvalitativnih reakcija za određivanje sadržaja određenih jedinjenja. Takva vizualna analiza omogućava vam da odmah shvatite da li su potrebne tvari prisutne, a ako nisu prisutne, možete značajno smanjiti daljnje eksperimente kako biste ih identificirali. Ove reakcije uključuju ninhidrin, koji je glavni u vizuelnom određivanju amino spojeva.
Šta je ovo?
Ninhidrin je dikarbonil jedinjenje koje sadrži jedan aromatični prsten sa heterociklom vezan za njega, čiji drugi atom ima 2 hidroksilne grupe (OH-). Ova supstanca se dobija direktnom oksidacijom inandiona - 1, 3, i stoga, prema međunarodnoj nomenklaturi, ima sledeći naziv: 2, 2 - dihidroksiinandion -1, 3 (slika 1).
Čisti ninhidrin je žuti ili bijeli kristalboje koje se, kada se zagreju, dobro otapaju u vodi i drugim polarnim organskim rastvaračima, kao što je aceton. Ovo je prilično štetna tvar, ako dođe u dodir s kožom u velikim količinama ili sluznicom, uzrokuje iritaciju, uključujući i udisanje. Rad sa ovim jedinjenjem treba biti oprezan i samo u rukavicama, jer kada dođe u kontakt sa kožom, on reaguje sa proteinima ćelija kože i boji je u ljubičastu boju.
Reaktivne supstance
Kao što je već spomenuto, reakcija ninhidrina se prvenstveno koristi za vizuelno određivanje sadržaja amino spojeva:
- α-aminokiseline (uključujući proteine);
- amino šećeri;
- alkaloidi koji sadrže –NH2 i -NH grupe;
- razni amini.
Treba napomenuti da sekundarni i tercijarni amini ponekad reaguju vrlo slabo, pa je potrebno više istraživanja da bi se potvrdilo njihovo prisustvo.
Različite metode hromatografije se koriste za kvantitativno određivanje, na primjer, papirna hromatografija (BC), tankoslojna hromatografija (TLC) ili ispiranjem čvrstih nosača rastvorom ninhidrina u različitim medijima.
Ova reakcija nije specifična za amino spojeve, jer reagens može ući u nju sa svim odjednom. Međutim, sa strane produkata reakcije, ima posebnost u vidu oslobađanja mjehurića ugljičnog dioksida (CO2), a to je tipično samo pri interakciji sa α-amino kiseline.
Karakteristike mehanizma
BU literaturi postoje različite interpretacije jednačine reakcije ninhidrina. Neki istraživači izostavljaju stvaranje hirindantina iz 2-aminoinandiona, koji uz učešće amonijaka i ninhidrina također tvori supstancu za bojenje pod nazivom "Ruemanova ljubičasta" (ili "Ruemanova plava"), dok drugi, naprotiv, pretpostavljaju samo njegovu učešće bez prisustva intermedijarnih amino proizvoda. Postoje i neke interesantne tačke u zapisu o samoj reakciji, a posebno se radi o metodama vezivanja amino derivata ninhidrina na njegov glavni molekul da bi se formirala boja. Ostaje upitna i naznaka mjesta "hodajućeg vodonika" dobijenog intermedijarnim aminom iz vodenog medija: može biti ili u ketonskoj grupi ili pored –NH2.
U stvarnosti, nijansa sa H atomom je beznačajna, jer njegov položaj u jedinjenju ne igra posebnu ulogu u toku reakcije, pa na to ne treba obraćati pažnju. Što se tiče izostavljanja jedne od mogućih faza, razlog je u teorijskom aspektu: do sada nije precizno utvrđen tačan mehanizam nastanka Ruemanovog ljubičastog, pa se mogu pronaći sasvim različite sheme reakcije ninhidrina.
Najpotpuniji mogući tok interakcije reagensa sa amino jedinjenjima će biti predložen u nastavku.
Mehanizam reakcije
Prvo, ninhidrin interaguje sa α-amino kiselinom, vezujući je na mestu cepanja hidroksi grupa i formirajući proizvod kondenzacije (slika 2a). Zatim se potonji uništava, oslobađajući intermedijarni amin, aldehid i ugljični dioksid (slika 2b). Od konačnog proizvoda prilikom spajanjaninhidrina, sintetizira se Rueman purpurna struktura (diketonhidrindenketohidrinamin, slika 2c). Takođe se ukazuje na moguće stvaranje hidrindatina (redukovanog ninhidrina) iz intermedijarnog amina, koji se takođe pretvara u jedinjenje za bojenje u prisustvu amonijaka (tačnije, amonijum hidroksida) sa viškom samog reagensa (slika 2d).
Nastanak hidrindatina je dokazao sam Rueman kada sumporovodik deluje na molekul ninhidrina. Ovo jedinjenje je u stanju da se rastvori u natrijum karbonatu Na2CO3, obojejući rastvor tamno crvenom bojom. A kada se doda razrijeđena hlorovodonična kiselina, hidrindant se taloži.
Najvjerovatnije su međuamin, hidridantin, ninhidrin i struktura boje, zbog svoje nestabilnosti pri zagrijavanju, u nekoj ravnoteži, što omogućava prisustvo nekoliko dodatnih faza.
Ovaj mehanizam je pogodan za objašnjenje reakcije ninhidrina s drugim amino spojevima, sa izuzetkom nusproizvoda koji nastaju eliminacijom ostatka strukture iz –NH2, -NH ili -N.
Biuret test i druge reakcije na proteine
Kvalitativna analiza peptidnih veza čak i neproteinskih struktura može se obaviti ne samo uz učešće gore navedenog reagensa. Međutim, u slučaju reakcije ninhidrina na proteine, interakcija se ne odvija duž –CO-NH‒ grupa, već duž aminskih grupa. Postoji takozvana "biuretna reakcija", koju karakteriše dodavanje jona u rastvor sa amino jedinjenjimadvovalentni bakar iz CuSO4 ili Cu(OH)2 u alkalnom mediju (slika 3).
Tokom analize, u prisustvu potrebnih struktura, rastvor postaje tamnoplav zbog vezivanja peptidnih veza u kompleks boje, koji razlikuje jedan reagens od drugog. Zato su reakcije biureta i ninhidrina univerzalne u odnosu na proteinske i neproteinske strukture sa –CO-NH‒ grupom.
Prilikom određivanja cikličkih aminokiselina koristi se ksantoproteinska reakcija sa koncentrovanim rastvorom azotne kiseline HNO3 , koja daje žutu boju kada se nitrira. Kap reagensa na koži takođe pokazuje žutu boju reakcijom sa aminokiselinama u ćelijama kože. Dušična kiselina može izazvati opekotine i treba je rukovati u rukavicama.
Primjeri interakcije sa amino spojevima
Ninhidrinska reakcija za α-amino kiseline daje dobar vizuelni rezultat, osim strukture prolina i hidroksiprolina u boji, koje reaguju formiranjem žute boje. Moguće objašnjenje za ovaj efekat je pronađeno u drugim uslovima okoline interakcije ninhidrina sa ovim strukturama.
Reakcija sa amino grupom
Pošto test nije specifičan, vizuelna detekcija alanina upotrebom ninhidrinske reakcije u smeši nije moguća. Međutim, papirnom hromatografijom, kada se nanose uzorci različitih α-amino kiselina, prskaju ih vodenim rastvorom ninhidrina i razvijaju u posebnom mediju, može seizračunajte kvantitativni sastav ne samo jedinjenja za koje se tvrdi da jedinjenje, već i mnogih drugih.
Šematski, interakcija alanina sa ninhidrinom prati isti princip. Veže se za reagens na aminskoj grupi, i pod dejstvom aktivnih hidronijevih jona (H3O+) se odvaja na ugljeniku -azotna veza, koja se razlaže u acetaldehid (CH3COH) i ugljen dioksid (CO2). Drugi molekul ninhidrina se veže za dušik, istiskujući molekule vode, i formira se struktura boje (slika 4).
Reakcija sa heterocikličkim amino jedinjenjem
Reakcija ninhidrina sa prolinom je specifična, posebno u hromatografskim analizama, jer takve strukture u kiselom mediju prvo žute, a zatim postaju ljubičaste u neutralnom. Istraživači to objašnjavaju osobinom preraspodjele ciklusa u intermedijarnom jedinjenju, na koju utiče upravo prisustvo velikog broja vodonikovih protona koji dopunjuju vanjski energetski nivo dušika.
Ne dolazi do razaranja heterocikla, a drugi molekul ninhidrina je vezan za njega na 4. atomu ugljika. Nakon daljeg zagrijavanja, nastala struktura u neutralnom mediju prelazi u Rueman ljubičastu (slika 5).
Priprema glavnog reagensa
Ninhidrinski test se izvodi sa različitim rastvorima, u zavisnosti od rastvaranja amino struktura u određenim organskim ineorganska jedinjenja.
Glavni reagens je priprema 0,2% rastvora u vodi. Ovo je raznovrsna mješavina, budući da se većina jedinjenja dobro otapa u H2O. Za dobijanje sveže pripremljenog reagensa, uzorak od 0,2 g hemijski čistog ninhidrina se razblaži u 100 ml vode.
Vrijedi napomenuti da je za neke analizirane otopine ova koncentracija nedovoljna, pa se mogu pripremiti 1% ili 2% otopine. Ovo je tipično za ekstrakte iz medicinskih sirovina, jer sadrže različite klase amino jedinjenja.
Kada se provode hromatografske studije, otopine, na primjer, pri ispiranju smjese na čvrstom nosaču kroz kolonu, mogu se pripremiti u alkoholu, dimetil sulfoksidu, acetonu i drugim polarnim rastvaračima - sve će ovisiti o rastvaraču određenih amino strukture.
Prijava
Reakcija ninhidrina omogućava detekciju mnogih amino spojeva u rastvoru, što ga čini jednim od prvih koji se koristi u kvalitativnoj analizi organskih supstanci. Vizuelno određivanje značajno smanjuje broj eksperimenata, posebno kada se analiziraju slabo proučavane biljke, lijekovi i oblici doziranja, kao i nepoznata rješenja i mješavine.
U forenzičkoj nauci, ova metoda se široko koristi za određivanje prisutnosti tragova znoja na bilo kojoj površini.
Čak i uprkos nespecifičnosti reakcije, povlačenje reakcije ninhidrina iz hemijske prakse je nemoguće, jerZamjena ove supstance sa manje toksičnim analozima (npr. oksolin) pokazala je da imaju lošiju osjetljivost na amino grupe i ne daju dobre rezultate u fotometrijskim analizama.
